不形成二聚体、 不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异性结合。
[0039] 所使用的DNA标签，是指添加在PCR引物5'末端的一小段碱基序列，针对每个样 品的PCR引物，其中的每对引物中的至少一条与一种DNA标签相连接，通过PCR扩增使该种 样品来源的PCR产物带上相应的DNA标签，从而通过DNA标签精确地表征DNA的样本来源， 并通过将多个不同样品来源的PCR产物（带有不同的DNA标签）混合成一个文库，从而实 现一次测序中完成多个样品的高通量测序，其中，同一批待检测样品所用的标签的碱基个 数相同。
[0040] 本发明所述的DNA标签，可以在一条PCR引物中引入，也可以在两条PCR扩增引物 中引入，所述的DNA标签序列与扩增引物相对应，可分为正向标签和反向标签序列，两者可 以是相同的，也可以是不同的，其中，在PCR引物的5'末端添加DNA标签形成"标签引物"， 具体为：
[0041] 正向标签引物=5' -正向标签-正在扩增引物-3'端。
[0042] 反向标签引物=5' -反向标签-反向扩增引物-3'端。正向标签和反向标签，序 列可以相同，也可以不同。
[0043] 每对标签引物由两部分组成，两条引物中的至少一条分别为5'端的DNA标签和3' 端的扩增引物，其中，DNA标签用于在PCR扩增反应中标记PCR产物，扩增引物部分与模板 碱基互补配对，从而启动PCR聚合反应。
[0044] 实施例1 一种DNA标签
[0045] 本实施例在满足上述DNA标签设计条件的基础上，设计了三组特异性高的DNA标 签，如表1、表2、表3所示，其中，表1的DNA标签序列为6个碱基，表2的DNA标签序列为 7个碱基，表3的DNA标签序列为8个碱基，其中，同一个测序反应体系的PCR扩增引物，选 用同一个列表中的DNA标签，通过与PCR扩增引物相结合，组成相应的标签扩增引物。
[0046] 表1 DNA标签序列（6bp)
[0047]
[0052] 实施例2标签PCR引物、由PCR引物对和DNA标签构建的测序文库的试剂盒
[0053] 1、PCR扩增引物
[0054] 本实施例以EGFR基因和BRAF基因突变检测为例，使用实施例1中所述DNA标签序 列，与目标检测的EGFR基因和BRAF基因突变位点的扩增引物，构建成测序文库的试剂盒。 即构建具体的标签PCR引物，根据本发明确定多种DNA样本目标检测基因是否存在突变的 方法。
[0055] 本发明针对EGFR基因和BRAF基因设计PCR引物，利用该组PCR引物将DNA样品 进行PCR扩增，能够一步PCR扩增出目标检测基因片段，具体PCR引物为：
[0056] 表4 PCR扩增引物
[0057]
[0058] 2、标签PCR引物和DNA标签构建测序文库的试剂盒
[0059] 本发明DNA标签构建测序文库试剂盒，包括有：针对不同样品的不同PCR引物组， 所述每一组PCR引物包含有至少一对PCR引物对，且每对PCR引物对中至少一条的5'端连 接有DNA标签序列，所述同一引物组的DNA标签序列相同，不同引物组的DNA标签序列不 同，所述DNA标签序列来源于实施例1，所述PCR引物来源于实施例2。
[0060] 本实施例中，使用上述扩增引物和表3中DNA标签构建标签PCR引物，在EGFR基 因和BRAF基因的正向扩增引物和反向扩增引物的5'末端均引入相同的DNA标签，从而形 成"标签引物"，并将该标签扩增引物混合，形成标签引物组，实现一个样品中目标检测EGFR 基因和BRAF基因含有突变位点序列的并行扩增。
[0061] 每组标签PCR引物可分别对应于一个待检测样品，其中，第一样品使用一种DNA标 签与表4所述的扩增引物相连，从而形成第一样品的"标签引物组"，第二样品使用另一种 DNA标签与表4所述的扩增引物相连，从而形成第二样品的"标签引物组"，如此类推，不同 样品的PCR扩增引物，使用不同的DNA标签进行标记，并形成与待检测样品一一对应的"标 签引物组"，具体如表5所示，本实施例使用根据上述原则构建的标签引物，针对20种样品 分别设计了 5'端连接有DNA标签的扩增引物。
[0062] 表5标签PCR引物
[0063]
[0064]
[0065] 标签PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分 别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的存液，其中，每种标签存液分开保 存，并做好标记。
[0066] 实施例3使用实施例2中标签PCR引物对样品进行检测
[0067] 一、样本的DNA提取：
[0068] 参照AxyPr印全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。
[0069] 二、待测样品的PCR扩增
[0070] 配制标签引物工作液：依照表5中20个样本的顺序，分别取带有DNA标签的PCR 引物贮存液l〇〇ul于1. 5ml微量离心管中，组装成20管标签PCR扩增引物，混合均匀即为 多重PCR引物工作液，针对每一种样本，每管工作液中含有5'端引入特定DNA标签的、针对 EGFR基因和BRAF基因的扩增引物。分别扩增含突变位点的靶标序列，PCR反应体系如下：
[0071]
[0072] ?0?扩增程序为：95￡€31^11 ;941€2〇8,561€3〇8,721€3〇8,30个循环；72°(：1〇111111;
[0073] 将20个样品PCR反应后的产物混合，并进行2. 5%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大 小为110~210bp的片段，纯化产物做好标记，于4°C保存备用。
[0074] 三、末端修复
[0075] 将步骤二的纯化产物进行末端修复，在1. 5ml的离心管中配制末端修复反应体 系：具体如下：
[0076]
[0077] 将上述配制所得的混合液置于25°C，进行反应lh。反应完成后利用市售的试剂盒 或磁珠进行纯化，最后纯化产物溶于40 y 1的洗脱缓冲液中。
[0078] 四、连接接头
[0079] 本实施例中，所选择的A1接头和A2接头具体如表6所示，其中，不同样本使用相 冋的A1接头和相冋的A2接头。
[0080] 表6 A1接头和A2接头
[0081]
[0082] 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用lOmmol/ L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的存液。
[0083] 各取A1接头和A2接头贮存液100ul于1. 5ml微量离心管中，配制成接头工作液；
[0084] 配置连接接头反应体系，具体步骤如下：
[0085]
[0086]
[0087] 配置好的反应体系置于20°C，20min ;65°C，15min。反应完成后使用磁珠进行纯 化；纯化产物置于4°C保存备用。
[0088] 五、文库检测
[0089] 扩增所得PCR产物进行纯化，并用Agilent Bioanalyzer2100或Q-PCR检测片段 大小及文库浓度。
[0090] 六、使用Ion Proton?制备测序模板
[0091] 根据Ion Proton?测序仪配套试剂盒，使用步骤五所得测序文库制备测序模板，具 体操作，参看产品说明书。
[0092] 七、上机测序
[0093] 严格按照仪器操作说明书进行测序操作，本实施例中采用PI芯片，在芯片中加载 酶、测序引物和制备好的测序模板等，测序过程约2. 5个小时，便可得到测序序列信息。 [0094] 八、测序结果的分析
[0095] 根据DNA标签序列与样品1~20的对应关系，将每个样品测序所得的数据与直接 测序法进行对比，计算本发明所提供的检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的EGFR 基因和BRAF基因目标突变位点的检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提 供的标签扩增引物能够在检测过程中准确地检测出20个样品的EGFR和BRAF基因目标突 变位点的SNP类型，且结果稳定可靠。具体的测序结果如下：
[0096] 表7检测结果对比
[0097]
[0098]
[0099] 实施例4选择不同长度DNA标签对测序结果的影响 [0100] 一、标签PCR引物的设计（不同长度DNA标签的选择）
[0101] 以EGFR基因和BRAF基因为例，使用表4中扩增引物，分别与表1(SEQ ID NO. 1~ 20)、表 2 (SEQ ID NO. 21 ~40)、表 3 (SEQ ID NO. 41 ~60)的 DNA 标签，构建标签 PCR 引物， 具体如表8所示。
[0102] 本实施例中，在EGFR基因和BRAF基因的正向扩增引物和反向扩增引物的5'末 端均引入相同的DNA标签，从而形成"标签引物"，并将该标签扩增引物