步包括：S8,对DNA文库进行检测。
[0036] 优选的，对DNA文库进行检测包括：使用Agilent 2100Bioanalyzer(安捷伦2100 生物分析仪）检测DNA文库的插入片段大小；使用qPCR定量检测DNA文库的产量。
[0037] 下面将结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。
[0038] 根据本发明一典型的实施例，利用微量DNA样本构建DNA文库的方法包括：
[0039] 1)提取DNA样本，并在目的DNA样品掺入500ng Carrier RNA ;
[0040] 2) DNA 片段化
[0041] 使用超声波打断仪（Covaris LE220R)将样品按照表1打断参数打断成主带在 150bp-300bp 的 DNA 片段；
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 3) DNA片段末端修复及3'端添加 A碱基；
[0045] 4)接头的连接
[0046] 将末端连接A碱基的DNA随机片段末端连接序列已知的接头（Illumina测序接 头）；
[0047] 5) PCR 扩增
[0048] 根据已知的接头序列设计引物，进行PCR扩增，得到FFPE样本DNA文库；
[0049] 6)基于安捷伦SureSelect目标区域捕获平台的探针杂交捕获；
[0050] 7)捕获后产物的洗脱及PCR扩增；
[0051] 根据已知的接头序列引物，进行PCR富集，得到最终文库；
[0052] 8)文库检测
[0053] 使用安捷伦2100生物分析仪检测插入片段大小；使用qPCR定量检测文库产量。
[0054] 实施例1
[0055] 非小细胞肺癌患者FFPE样本2例，样品名称和提取量见表2。
[0056] 表 2
[0058] 1)DNA的片段化
[0059] 使用超声波破碎仪（Covaris LE220R)将目标DNA及掺入的Carrier RNA (500ng) 按照特定的打断参数进行DNA的片段化，Covaris LE220R的打断参数设置见表1。
[0060] 打断后的DNA经过I. 8X的AMPure XP磁珠纯化后进行下一步操作。
[0061] 2)末端修复及3 '端加 A碱基
[0062] 参照下表3配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
[0063] 表 3
[0064]
[0065] 放入PCR仪，按下表设置程序进行反应（盖温设为70°C，前30min不盖热盖，温度 到达65°C，立即盖上热盖），步骤见表4。
[0066] 表 4
[0069] 3)接头连接
[0070] 按照下表5的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
[0071] 表 5
[0073] 分为2管，每管55ul，放于PCR仪上，20°C反应15min。反应结束后，使用0. 8X的 AMPure XP磁珠纯化DNA样本。
[0074] 4) PCR 扩增
[0075] 按照下表6的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
[0076] 表 6
[0077]
[0082] 用I. 8 X的AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化，最后将文库溶于50ul NF-water 中。将纯化产物进行Qubit定量。
[0083] 5)文库杂交
[0084] 5. 1将各文库混合，置于浓缩仪中蒸干，温度设置为45°C，一般需要1小时左右。
[0085] 5. 2向蒸干的样品中加入I. 4ul纯水，再各加入适量的针对接头序列进行封闭的 Blocking oligos (寡核苷酸封闭剂）。
[0086] 5. 3后续杂交和捕获方法参照安捷伦公司SureSeclect XT杂交捕获方法。即65°C 杂交16~24h，使用DynabeadsMyone Streptavidin Tl链霉亲和素磁珠进行捕获，采用 SureSelect Washl 室温洗脱一遍，SureSelect Wash2 在 65 °C 洗脱三遍。
[0087] 6)捕获后文库PCR扩增
[0088] 按照下表8配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
[0089] 表 8
[0090]
[0095] 用I. 8 X的AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化，最后将文库溶于30ul NF-water 中。将纯化产物进行Qubit精确定量。
[0096] 7)文库检测
[0097] 将步骤6)中的纯化产物稀释到2ng/ul，取出Iul采用安捷伦2100生物分析仪 (美国安捷伦公司）检测插入片段大小，检测结果如图1所示，构建的文库总长度在300bp 左右，符合PE150的测序策略；另外，再取出Iul用于qPCR检测，根据检测结果决定上机浓 度。
[0098] 根据上步所得的浓度，将文库稀释到上机要求后（2nM)，根据计划数据量要求在 Illumina测序平台上进行PE150测序。
[0099] 8)上机结果质控
[0100] 8. 1对所建文库进行GC分离度和GC含量进行评估，如图2A和2B所示，
[0101] 8. 2对所建文库的测序随机性进行评估，如图3A和图3B所示：
[0102] 8. 3测序质控文件见表10。
[0103] 表 10
[0104]
[0106] 从表10可知，两个微量FFPE样本数据产量和目标区域覆盖度均达到预期，目标区 域的测序深度也分别达到了 200X和500X以上，目标区域的重复率也控制在了 60 %左右。 说明本发明成功建立了针对微量FFPE样本进行片段化及目标区域捕获并进行二代测序的 技术。
[0107] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
[0108] 本发明通过在目标DNA中添加外源的Carrier RNA，控制Cocaris打断仪的打断参 数，对20~50ng提取量的FFPE样品进行片段化，进而采用优化过的微量建库方法，在尽量 控制PCR循环数的前提下完成建库，通过后续的混合杂交捕获和上机测序，得到比较高质 量的数据。从而填补微量FFPE样品建库杂交捕获的技术空白。
[0109] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种微量DNA样本片段化的方法，其特征在于，包括以下步骤： Sl，在所述微量DNA样本中加入Carrier RNA，得到待片段化的样本； S2，对所述待片段化的样本进行片段化处理。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量DNA样本为来自FFPE样品的 DNA03. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微量DNA样本中DNA的量为20~ 50ng〇4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Carrier RNA的加入量为500~ 1000 ng05. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述待片段化的样本进行片段化处理 是采用超声波打断仪对所述待片段化的样本进行超声波打断。6. -种利用微量DNA样本构建DNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤： Sl，采用如权利要求1至5中任一项所述的微量DNA样本片段化的方法对所述微量DNA 样本进行片段化，得到DNA片段； 52, 对所述DNA片段的末端进行修复及3'端添加A碱基，得到末端连接A碱基的DNA 片段； 53, 将所述末端连接A碱基的DNA片段的末端连接接头； 54, 根据所述接头的序列设计引物进行PCR扩增，得到样本DNA文库； 55, 基于目标区域捕获平台的探针杂交捕获目标DNA片段； 56, 洗脱及PCR扩增所述目标DNA片段，利用根据所述接头的序列设计的引物，对所述 目标DNA片段进行PCR扩增，得到所述DNA文库。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标区域捕获平台为安捷伦 SureSelect液相杂交捕获平台。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括： S8,对所述DNA文库进行检测。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对所述DNA文库进行检测包括：使用安捷 伦2100BioanalyZer检测所述DNA文库的插入片段大小；使用qPCR定量检测所述DNA文库 的产量。
【专利摘要】本发明公开了一种微量DNA样本片段化的方法及利用微量DNA样本构建DNA文库的方法。其中，微量DNA样本片段化的方法包括以下步骤：S1，在微量DNA样本中加入Carrier RNA，得到待片段化的样本；S2，对待片段化的样本进行片段化处理。发明人发现，通过对目的DNA中添加外源的Carrier RNA，即将目标DNA与Carrier RNA进行混合，再进行片段化能够对目标DNA起到保护作用，最大限度的降低打断仪对微量DNA的破坏作用，使得微量的FFPE样品DNA进行全基因组建库测序乃至杂交捕获测序成为现实。
【IPC分类】C12N15/10, C40B50/06, C12Q1/68
【公开号】CN104946629
【申请号】CN201510413466
【发明人】蒋智, 张振宇, 曹志生, 杜长诗, 魏勤
【申请人】天津诺禾医学检验所有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月14日