受态细胞，37度培养过夜后，挑单克隆送样测序，选取测序成功的 PCMV6-AC-GFP37TAG重组载体进行后续试验。
[0032] DpnI酶切反应体系：
[0035] 4.荧光显微镜观察含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-I和 膀胱癌细胞5637中的表达情况
[0036] 将适量细胞接种至confocal皿中，待细胞密度长至60% -80%后，将培养基换 成无血清培养基。将需要转染的 psiCHECK-2-hUPII/AcKRS，psiCHECK-2-hTERT/tRNA， PCMV6-AC-GFP37TAG质粒（I yg)和lipo2000脂质体（1 μ 1)在无血清培养基中混匀，室温 静置15分钟后加入细胞培养基中，5小时后更换为含10%胎牛血清的培养基。转染后24 小时至48小时后，用荧光显微镜观察拍照。
[0037] 5. Western blot检测GFP含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞 SV-HUC-I和膀胱癌细胞5637中的表达情况
[0038] 待转染的细胞密度长至60% -80%，更换新鲜培养基。将需要转染的质粒（1 μ g) 和lip〇2000脂质体（1 μ 1)在无血清培养基中混匀，室温静置15分钟后加入细胞培养基 中。按照需要在转染后24小时至48小时后收取细胞样品，用PBS反复清洗几次，之后加入 双蒸水裂解细胞，加入loading后在沸水中煮样品20-30分钟。
[0039] 采用SDS-PAGE标准方法配制聚丙烯酰胺蛋白胶，将玻璃板凝胶放入电泳槽中，并 在槽中加入电泳液，加入蛋白marker及制备的蛋白样品，接通电源跑胶，在浓缩胶部分采 用80V稳压，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后调高至120V稳压。停止电泳后，取出凝胶，裁剪 与凝胶大小相等的滤纸和硝酸纤维素膜，用溶液法转膜系统，350mA转膜I. 5-2小时。取出 硝酸纤维素膜用丽春红染色，观察蛋白转移效果，用铅笔进行标记，并将膜裁剪至合适大小 后用TBST脱色5分钟。
[0040] 用新鲜 5% (w/v)脱脂牛奶配制合 1:5000 的 GFP 抗体（Santa Cruz, sc-9996)，4 度过夜，之后用TBST洗膜3次，每次5分钟，之后取出滤膜用1:2000的羊抗鼠二抗（Santa Cruz，sc-2005)室温杂膜2小时，之后用TBST洗膜3次，每次5分钟。之后采用化学发光底 物检查信号。用X光片在暗室中进行曝光，显影，停影，定影。
[0041] 本发明利用CRISPR_Cas9系统成功构建了能在体外特异识别并杀伤膀胱癌细胞 的逻辑与门基因线路。但后续研究发现，CRISPR-Cas9系统在膀胱癌细胞中存在显著的脱靶 效应，因此仍需要寻找特异性更高的生物正交系统来构建新一代的基因线路，提高膀胱癌 识别和干预的特异性。本发明选用的逻辑与门乙酰化赖氨酸基因线路包括膀胱癌特异启动 子和在真核细胞中生物正交的乙酰化赖氨酸插入系统。逻辑与门中的与门（AND gate)又称 "与电路"，是执行"与"运算的基本逻辑门电路；有多个输入端，一个输出端。当所有的输入 端同时输入时，输出端才输出；只要有一个输入端不输入，则输出端不输出。真核细胞中生 物正交的乙酰化赖氨酸插入系统包括乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶，乙酰化赖氨酸tRNA， 含有UAG终止密码子的效应基因和N-乙酰-L-赖氨酸，四个元件缺少其中一个，则效应基 因得不到全长表达。绿色荧光蛋白GFP作为效应基因，可以用来表征膀胱癌特异启动子启 动下游基因的细胞选择性。通过建立上述乙酰化赖氨酸基因线路干预膀胱癌研究的科学实 验体系，实现在活细胞中可控高效地操纵多个膀胱癌靶标，并通过逻辑与门的方式多靶点 区分正常细胞和膀胱癌细胞，揭示乙酰化赖氨酸基因线路干预膀胱癌的分子机制，为基因 线路干预膀胱癌提供理论基础和科学依据。
[0042] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，其特征在于， a) 用PCR方法扩增序列：如SEQIDN0:l所示的hUPII启动子序列，如SEQIDN0:2所 示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQIDN0:3所示的hTERT启动子序列，如SEQID NO: 4所示的tRNA序列，如以SEQIDNO: 5所示的pCMV6-AC-GFP质粒序列为模板PCR扩增 SEQIDN0:6 所示的pCMV6-AC-GFP37TAG质粒序列； b) 将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如SEQID N0:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体； c) 将所述重组载体与所述PCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建出所 述基因线路。2. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述膀胱癌细胞是5637。3. 如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤c)中，将含有UAG终止密 码子的效应基因一起转入所述膀胱癌细胞。4. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。5. -种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，包括序列如SEQIDN0:8所示的 psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体、序列如SEQIDN0:9 所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA 重组载体、序列如SEQIDN0:6所示pCMV6-AC-GFP37TAG质粒。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括含有UAG终止密码子的效应基因。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
【专利摘要】本发明公开了一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，a)用PCR方法扩增序列：如SEQ？ID？NO:1所示的hUPII启动子序列，如SEQ？ID？NO:2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQ？ID？NO:3所示的hTERT启动子序列，如SEQ？ID？NO:4所示的tRNA序列，如SEQ？ID？NO:6所示的pCMV6-AC-GFP37TAG质粒序列；b)将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如SEQ？ID？NO:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体；c)将所述重组载体与所述pCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建出所述基因线路。当将上述基因线路转入膀胱癌细胞，并加入乙酰化赖氨酸时，绿色荧光蛋白只在膀胱癌细胞中表达，而在正常细胞中不表达。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/85
【公开号】CN105400816
【申请号】CN201510824077
【发明人】周庆, 黄卫人, 刘宇辰, 周泽强, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月24日