血管保护药物组合物及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种血管保护药物组合物，所述的药物组合物的活性成分仅为天麻素和薯蓣皂苷元，所述天麻素和薯蓣皂苷元的摩尔比为10～6:1～4。本发明也公开了一种血管保护药物组合物，所述的药物组合物包括摩尔比为10～6:1～4的天麻素和薯蓣皂苷元。本发明还公开了上述药物组合物在制备血管保护药物制剂中的用途。
【专利说明】
血管保护药物组合物及其用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种血管保护药物组合物及其用途，尤其是源自天然药材提取物的血 管保护药物组合物及其用途。
【背景技术】
[0002]血管新生(Angiogenesis)是在原有血管的基础上形成新血管的过程，多发生于癌 症、痴呆、心血管疾病、糖尿病等多种疾病中。血管新生包括分裂和出芽两个步骤。基底膜降 解和内皮细胞粘附性降低导致血管稳定性破坏，内皮细胞迀移和内皮干细胞增殖引起血管 出芽，内皮细胞和周细胞的募集导致管腔周围区域生成新的管腔，逐步形成成熟管腔。血管 新生受到血管生成开关的控制。血管生成开关包括血管生成促进因子和血管生成抑制因 子。当二者处于平衡状态时，血管稳定，若二者稳态失衡，会促进或抑制血管生成。促血管生 成因子包括VEGF，bFGF，PDGF，AngII等细胞因子，信号介质包括PKC，PI3K，Akt等 ；血管生成 抑制因子包括PEDF等。脑组织处于缺氧状态时，缺氧反应元件如HIF-Ia会诱导促血管生成 因子的表达，促进内皮细胞增殖和分化、促进细胞迀移，导致血管新生。
[0003] 申请号为01813403.3的中国专利申请公开了一种具有血管保护和抗氧化作用的 制剂，含有从柠檬中得到的松油烯以及维生素 E和/或辅酶Q。上述制剂主要用于预防动脉粥 样硬化。申请号为200480017771.6的中国专利申请公开了一种血管保护剂，包含聚二十级 醇、生育三烯酚和/或番茄红素、procyanidole低聚物以及富含ω-3、ω-6不饱和脂肪酸的 植物油。上述血管保护剂主要用于预防和治疗由血浆脂质过剩引起的血管损伤。由此可知， 目前用于缺氧状态下的血管保护制剂并不多见。
[0004] 目前，天然药材提取物在血管保护剂方面的应用已有研究。例如，申请号为 201110302835.9的中国专利申请公开了一种杜仲化学成分作为血管保护剂的新用途。该杜 仲提取物中包含至少一种选自以下的成分:京尼平苷、汉黄芩素、千叶素 Α、α_氧-β-D-葡萄 吡喃糖基-4,2'，三羟基二氢查耳酮、和白桦脂酸。上述杜仲提取物可以用作有效的血管 保护剂和/或降血压剂，用于治疗和/或预防血管增生性疾病。又如，申请号为 201210184134.4的中国专利申请公开了一种水杉皮提取物，由于其含有较丰富的原花色素 以及多酚类成分，具有很强的自由基清除作用和抗氧化能力、酪氨酸酶抑制作用、葡萄糖 苷酶抑制作用和心血管保护作用。但是，相对于大量的天然药材，天然药材提取物在血管保 护剂方面的相关报道仍然是少量的。
【发明内容】
[0005] 为了寻找更多的可用作血管保护剂的天然药材提取物，本申请的发明人进行了深 入研究。本发明的一个目的就在于提供一种血管保护药物组合物。本发明的另一个目的在 于提供上述血管保护药物组合物的用途。
[0006] 本发明提供一种血管保护药物组合物，所述的药物组合物的活性成分仅为天麻素 和薯蓣皂苷元，所述天麻素和薯蓣皂苷元的摩尔比为10~6:1~4。优选地，所述天麻素和薯 蓣皂苷元的摩尔比为10~7:1~3。根据本发明的一个【具体实施方式】，所述天麻素和薯蓣皂 苷元的摩尔比为8:2。
[0007] 本发明还提供一种血管保护药物组合物，所述的药物组合物包括摩尔比为10~6: 1~4的天麻素和薯蓣皂苷元。优选地，所述的药物组合物包括摩尔比为10~7:1~3的天麻 素和薯蓣皂苷元。根据本发明的一个【具体实施方式】，所述的药物组合物包括摩尔比为8:2的 天麻素和薯蓣皂苷元。
[0008] 本发明中，所述天麻素的化学SC13H18〇7，CAS登记号为62499-27-8,结构式如下：
[0009]
[0010] 本发明中，所述薯蓣皂苷元的化学式是C27H42〇3，CAS登记号为512-04-9,结构式如 下：
[0011]
[0012] 本发明还提供一种血管保护药物制剂，所述药物制剂含有上述血管保护药物组合 物和药学上可接受的辅料。根据本发明的药物制剂，每单位剂量的药物制剂中包括2~IOmg 天麻素和0.1~5mg薯蓣皂苷元;优选包括3~6mg天麻素和1~3mg薯蓣皂苷元;更优选包括 4.7mg天麻素和1.7mg薯截阜苷元。
[0013] 本发明的药物制剂形式没有特别限制，可以为经口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、 皮肤粘膜、静脉途径给药的多种剂型，例如颗粒剂、片剂(包括含片、咀嚼片）、丸剂(包括滴 丸)或胶囊剂。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。本发明的药 物组合物可以另外含有无药用活性的天然或合成添加剂或辅剂，例如粘合剂、崩解剂、润滑 剂、分离剂、溶剂、稳定剂等。本发明的粘合剂的具体实例包括但不限于淀粉、微晶纤维素、 藻酸盐、明胶、糖、纤维素醚和聚乙烯吡咯烷酮等。本发明的崩解剂的具体实例包括但不限 于淀粉和羟乙基淀粉等。本发明的润滑剂和分离剂包括但不限于滑石、硬脂酸盐(例如硬脂 酸钙和硬脂酸镁）、碳酸镁、碳酸钙、纤维素、氧化镁、胶态硅胶、硅酸盐(例如硅酸钠、硅酸 镁、硅酸钙和硅酸铝)等。本发明的溶剂的具体实例为水。本发明的稳定剂包括但不限于淀 粉衍生物等。
[0014] 本发明也提供上述药物组合物在制备血管保护药物制剂中的用途。优选地，所述 的血管保护药物制剂用于在缺氧状态下控制血管新生。更优选地，所述的血管保护药物制 剂通过降低缺氧诱导因子HIF-Ia和血管内皮生长因子VEGF的表达来控制血管新生。
【附图说明】
[0015] 图1.不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷元下缺氧HUVECs的存活率。
[0016] 图2.不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷元下的缺氧HUVECs中的活性氧含量。
[0017]图3.不同组别的缺氧HUVECs的细胞比例；其中，给药组的天麻素和薯蓣皂苷元的 摩尔浓度配比为8:2。
[0018]图4.不同组别VEGF的western blot表达;其中，给药组的天麻素和薯截阜苷元的 摩尔浓度配比为8:2。
[0019]图5.不同组别HIF-Ia的western blot表达；其中，给药组的天麻素和薯截阜苷元 的摩尔浓度配比为8:2。
[0020]图6.不同组别iNOS的western blot表达;其中，给药组的天麻素和薯截阜苷元的 摩尔浓度配比为8:2。
[0021]图7.不同组别eNOS的western blot表达;其中，给药组的天麻素和薯截阜苷元的 摩尔浓度配比为8:2。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于 此。
[0023]〈药品与仪器〉
[0024] 本发明的实施例的药品与试剂如下：
[0025] 天麻素标准品：中国药品生物制品检定所，批号110807-201407。
[0026] 署预阜昔兀标准品：中国药品生物制品检定所，批号111539-200001。
[0027] VEGF抗体：英国 Abcam公司，Ab46154。
[0028] HIF-la 抗体:英国 Abcam 公司，Ab2185。
[0029] iNOS 抗体：英国 Abeam 公司，Abl5323。
[0030] eNOS 抗体：美国 ImmunoWay 公司，YM3164。
[0031]山羊抗兔IgG(H+L)，HRP:天德悦(北京)生物科技有限责任公司。
[0032] DEMD/F12培养基：美国Gibco公司，批号929215。
[0033] 胎牛血清(FBS):美国Hyclone公司，批号AUB34148。
[0034] 明胶:美国西格玛奥德里奇公司（Sigma)，批号G7765。
[0035] I型胶原酶:美国西格玛奥德里奇公司，批号C9722。
[0036] 胰蛋白酶:Amresco公司，北京拜尔迪生物技术公司分装。
[0037] ECM培养基：美国ScienCell公司，批号1001。
[0038] Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，批号 C1063〇
[0039] CCK-8试剂盒：日本同仁化学研究所，批号FQ659。
[0040] 卩85:称取恥(：18.(^，1((：10.28，诎2?〇4〇.28，恥2册〇4.12!12〇2.98，加入三蒸水定 容至1000 mL，调节pH 7.2，0.22μπι滤膜过滤除菌，分装。4°C储存，-20 °C冻存。
[00411 DMEM/F12培养液:将1袋DMEM/F12干粉培养基溶于三蒸水后，加入1.2g NaHCO3,磁 力搅拌直至颗粒完全溶解，加水至1000mL，4°C静置2h，瓶底无沉淀时使用0.22ym滤膜过滤 除菌，分装。4 °C储存，-20 °C冻存。
[0042] 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化液:分别称取0.05g胰蛋白酶、0.02g EDTA粉末 (Amresco公司，北京拜尔迪生物技术公司分装），充分溶于IOOmL PBS中，0.22μπι微孔滤膜过 滤除菌，分装，-20 °C保存备用。
[0043] 3 % BSA-TBST: 3 % w/v牛血清白蛋白 BSA，I X TBS(Tr is-HCl缓冲盐溶液），0 · 1 % Tween-20。
[0044] 5%脱脂奶粉4851':5%1八脱脂奶粉，1\185(1>4-!1(：1缓冲盐溶液），0.1% Tween-20〇
[0045] TBST: I X TBS( Tr is-HCl缓冲盐溶液），0 · 1 % Tween-20 〇
[0046] 天麻素溶液:称取I.OOmg的天麻素，溶于ImL的三蒸水中，配置成浓度为3493μΜ的 天麻素母液，4 °C储存，使用时采用DMEM/F12培养液稀释。
[0047] 薯蓣皂苷元溶液:称取2. OSmg薯蓣皂苷元，溶于250yL的无水乙醇中，配制成浓度 为20mM的母液，4 °C储存，使用时采用DMEM/F12培养液稀释。
[0048] 本发明的实施例的主要实验仪器如下： 全自动流式细胞分析仪 美国贝克曼库尔特
[0049] (Beckman Coulter), FC500 倒置焚光显微镜 日本奥林巴司(Olympus)， LX-B1 多功能微孔板检测仪 美国分子仪器公司 Frcsco低温冷冻禺心机 赛默飞世尔(Thermo)公司 MultiSkan3酶标仪 赛默飞世尔(Thermo)公司 Mini P-4电漆槽 凯元信瑞仪器有限公司 (Cavoy)
[0050]湿转电泳槽 凯元信瑞仪器有限公司 (Cavoy) 电泳仪 伯乐公司(Bio-Rad) 半干槽 伯乐公司(Bio-Rad) 水平脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造 有限公司
[0051 ]〈受试细胞的制备〉
[0052] 下面介绍作为受试细胞的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养过程。
[0053] 1.实验准备
[0054] 25cm2细胞培养瓶用2 %的明胶包被，于4 °C冰箱中过夜，用之前在37 °C细胞培养箱 中放置30min以上，吸弃明胶后，PBS冲洗3次。
[0055] 500mL蓝口玻璃瓶于高压灭菌锅中灭菌后，加入300mL预冷的PBS，用以运输脐带。
[0056] 2 .HUVECs的分离培养
[0057] (1)取脐带:在无菌条件下，剖腹产手术后立即取新生儿脐带，脐带应表面色泽白 嫩，有光泽，并且去除弯曲、血肿、两端有夹痕的部分后，脐带的长度为15~30cm，挤压除净 脐静脉内的残血后，立即投入4 °C预冷的PBS中，6h内完成HUVECs分离。
[0058] (2)冲洗:在超净工作台内，用PBS将脐带表面残血冲洗干净后放入弯盘中，脐静脉 的一端插入大鼠灌胃器，并用止血钳固定，大鼠灌胃器另一端连接50mL注射器，用PBS缓冲 液缓慢注射，冲洗脐静脉内残留的血栓，反复冲洗直至流出的液体变为无色后，再用PBS继 续冲洗，冲洗过程中动作应缓慢。
[0059] (3)消化:将10~15mL 0.1%1型胶原酶缓慢注入脐静脉内，直至有胶原酶流出，用 止血钳夹紧脐带的胶原酶流出端，继续注入胶原酶至脐静脉完全充盈为止，于37°C培养箱 中孵育5~8min，消化结束后抽出消化液，再次注入胶原酶进行消化，消化2次后，用20~ 30mL PBS冲洗脐带，将消化液和冲洗液一并收集入离心管内。
[0060] (4)收集细胞：1000 rpm离心10min，用PBS重悬、洗涤细胞两次，1500rpm离心10min， 收集细胞。
[0061 ] (5)细胞培养：以IOmL ECM培养液重悬，制成单细胞悬液，接种于用2%明胶包被的 25cm2细胞培养瓶内，于37 °C、5 % CO2培养箱培养。
[0062] (6)换液:细胞培养72h后，普通倒置显微镜下观察细胞的生长状况，换液。换液时， 小心吸出培养液后，加入5mL ECM培养液，置37 °C、5 %⑶:^培养箱继续培养。每2~3d换液1 次，并密切观察细胞的生长情况，3~5d后，细胞会生长融合成片，即可传代。
[0063] 3 .HUVECs 传代培养
[0064] HUVECs生长融合到90 %左右时，可以进行传代培养。首先，倾倒出培养液，用PBS洗 涤细胞1次，然后加入800yL的0.05 %胰酶/0.02 %EDTA消化液，消化1~2min，镜下观察细胞 皱缩变圆时，加入3mL含10 % FBS的ECM培养液终止消化，反复轻轻吹打瓶底，使细胞脱落，收 集细胞悬液，1500rpm离心5min，弃上清，按1:3接种于培养瓶中。第2~5代生长状态良好的 HUVECs即可用于实验。
[0065]〈缺氧HUVECs存活率〉
[0066]为了研究不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷元的组合对缺氧HUVECs存活率 的影响，进行如下实验：
[0067] 取第2~5代的HUVECs，将细胞以1\104个/孔接种于96孔板，每孔加入20(^1^含 10%FBS的DMEM/F12的完全培养基于37°C、5%C02的培养箱中培养，培养12h后，更换为无血 清的DMEM/F12的培养基继续培养12h。
[0068] 将细胞分为正常对照组（给予无血清的DMEM/F12培养液），模型组(给予无血清的 DMEM/F12培养液)和给药组(给予天麻素(Gas)和薯蓣皂苷元(Dio)的组合物，二者总共20μ Μ，稀释液为无血清的DMEM/F12培养液）；给药组按照摩尔浓度配比分组如下 :Gas:Di〇(10: 0)，Gas:Dio(9:l)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio(5:5)，Gas:Dio (0:10)。正常对照组在CO2培养箱中培养;模型组于三气培养箱（I % O2，5 % CO2，94 %N2)中培 养；给药组于三气培养箱（1 % O2，5 %⑶2，94 %N2)中培养。三组分别培养12h后，更换为含 10%CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2!1-四唑单钠 盐）的DMEM/F12培养液，37 °C孵育3h。使用多功能微孔板检测仪，于450nm处测定OD值。实验 重复3次。
[0069]在缺氧的同时给予不同配比的天麻素和薯蓣皂苷元，作用12h后测定细胞存活率。 不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷元下缺氧HUVECs的存活率参见图1。由图可知，缺氧 12h显著影响细胞的存活率42.18% (P〈0.05)。对于不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷 元，在Gas :Dio = 9 :1，8: 2,7 :3,6:4,5 :5时，可以明显提高缺氧损伤的HUVECs的存活率(P〈 0·01)〇
[0070]〈缺氧HUVECs中活性氧含量〉
[0071]为了研究不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷元的组合物对缺氧HUVECs中活 性氧(ROS)含量的影响，进行如下实验：
[0072]使用全自动流式细胞分析仪检测细胞内ROS的含量，操作方法如下：
[0073] (1)取第2~5代的!1爪^8，用0.05%胰蛋白酶/0.02^^0了厶消化计数后以6\105 个/孔接种于6孔板，于含10%FBS的DMEM/F12的培养基中培养12h，然后更换为无血清的培 养基继续培养12h使细胞同步化。
[0074] (2)将细胞分为正常对照组(给予无血清的DMEM/F12培养液），模型组(给予无血清 的DMEM/F12培养液)和给药组(给予天麻素 (Gas)和薯蓣皂苷元(Dio)的组合物，二者总共20 μΜ，稀释液为无血清的DMEM/F12培养液）；给药组按照摩尔浓度配比分组如下:Gas:Di 〇(10: 0)，Gas:Dio(9:l)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio(5:5)，Gas:Dio (0:10)。正常对照组在CO2培养箱中培养;模型组于三气培养箱（I % O2，5 % CO2，94 %N2)中培 养;给药组于三气培养箱（1 % 〇2，5 %⑶2，94 % N2)中培养。三组分别培养12h后，按活性氧检 测试剂盒的说明书进行操作：
[0075]①按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DAU' ,7'-二氯荧光黄双醋酸盐），收集 细胞，将细胞悬浮于稀释好的DCFH-DA中，37 °C细胞培养箱内孵育20min，每隔3~5min颠倒 混匀，使探针和细胞充分接触。
[0076]②用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
[0077]③全自动流式细胞分析仪检测细胞ROS含量。数据以X 土s表示，采用SPSS17.0统计 软件进行分析。组间比较首先分析各组数据是否服从正态分布并检验方差齐性，如服从正 态分布且方差齐则进行One-Way ANOVA Dunnett t-test单侧检验。如果方差不齐，进行对 数转化后，再进行方差分析。
[0078] ROS包括O2'过氧化氢及羟化物等。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜， 进入细胞后，在细胞内被酯酶水解为不能透过细胞膜的DCFH，细胞内的ROS可以将无荧光的 DCFH氧化为有荧光的DCF(二氯荧光素），通过检测DCF的荧光，可定量测定细胞内ROS的水 平。不同摩尔浓度配比的天麻素和薯蓣皂苷元下的缺氧HUVECs中的活性氧(ROS)含量参见 图2。由图可知，缺氧12h后可刺激HUVECs产生大量R0S，与正常组相比具有显著性差异(P〈 0.05)。细胞处于缺氧状态时，天麻素和薯蓣皂苷元的7种比例均可以显著减少缺氧细胞中 ROS 含量(Ρ〈0·01)。
[0079] 〈缺氧HUVECs凋亡的保护作用〉
[0080] 为了研究天麻素和薯蓣皂苷元的组合物对缺氧HUVECs凋亡的保护作用，进行如下 实验：
[0081] (1)取对数生长期的HUVECs，消化计数后以3 X IO5个/孔接种于6孔板，于含10% FBS的DMEM/F12的培养基中培养12h，然后更换为无血清的培养基继续培养12h使细胞同步 化。
[0082] (2)将细胞分为正常对照组(给予无血清的DMEM/F12培养液），模型组(给予无血清 的DMEM/F12培养液)和给药组(给予天麻素(Gas)和薯蓣皂苷元(Dio)的组合物，二者总共20 μΜ，稀释液为无血清的DMEM/F12培养液）；给药组按照摩尔浓度配比分组如下:Gas:Di 〇(10: 0)，Gas:Dio(9:l)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio(5:5)，Gas:Dio (0:10)。正常对照组在CO2培养箱中培养;模型组于三气培养箱（I % O2，5 % CO2，94 %N2)中培 养;给药组于三气培养箱（1 % 〇2，5 % CO2，94 % N2)中培养。三组分别培养12h后，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行操作：
[0083]①把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化液消 化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。
[0084]②加入步骤①中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000 rpm离心5min， 弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
[0085] ③取重悬的细胞，1000 rpm离心5min，弃上清，加入195yL Annexin V-FITC结合液 轻轻重悬细胞。
[0086]④加入5yL Annexin V-FITC，轻轻混匀。
[0087] ⑤加入IOyL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
[0088] ⑥室温(20-25。〇避光孵育10~2011^11，随后置于冰浴中。
[0089] ⑦随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色 荧光。
[0090] ⑧结果判断:AnnexinV-FITC(-)PK-)正常细胞，Annexin V-FITC(-)PI( + )机械损 伤细胞，AnnexinV-FITC( + )PI( + )早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC( + )PI(_)晚期凋亡和坏死 细胞。
[0091] 实验结果参见图3。由图可知，与正常组细胞相比，模型组正常细胞的比例显著降 低，早凋和晚凋、坏死细胞的比例显著增加(P〈〇.05)。给予天麻素(Gas)和薯蓣皂苷元(Dio) 的组合物后，正常细胞的比例由59.17%增加到68.80% (P〈0.001);早期凋亡细胞比例由 17.97 %降低到14.23% (P〈0.05)，晚期凋亡和坏死的细胞比例由21.8%下降到16.3% (P〈 ο.οοι)〇
[0092] 〈缺氧HUVECs蛋白表达〉
[0093]为了研究天麻素和薯蓣皂苷元的组合物对缺氧HUVECs蛋白表达的影响，进行如下 实验：
[0094] (I)HUVECs全蛋白样品制备
[0095] 使用第2代至第5代HUVECs接种于25cm2培养瓶，10%FBS的DMEM/F12的完全培养基 于37 °C、5 % CO2的培养箱中培养，培养12h后，更换为无血清的DMEM/F12的培养基继续培养 12h使细胞生长同步化。将细胞分为正常对照组（给予无血清的DMEM/F12培养液），模型组 (给予无血清的DMEM/F12培养液）和给药组（给予天麻素(Gas)和薯蓣皂苷元(Dio)的组合 物，二者总共20μΜ，稀释液为无血清的DMEM/F12培养液）；给药组按照摩尔浓度配比分组如 下：Gas:Dio(10:0)，Gas:Dio(9:1)，Gas:Dio(8:2)，Gas:Dio(7:3)，Gas:Dio(6:4)，Gas:Dio (5 : 5)，Gas : Dio(0 :10)。弃培养液，正常对照组在⑶2培养箱中培养;模型组于三气培养箱 (1%〇2,5%0)2,94%吣）中培养 ；给药组于三气培养箱（1%02,5%邙2,94%吣）中培养。三组 分别培养12h后，弃培养基，用0.05 %胰蛋白酶/0.02 %EDTA消化液消化收集细胞至离心管， 1000 rpm离心5min，弃上清，PBS重悬细胞，将细胞移至1.5mL离心管，1000 rpm离心5min，弃上 清，以细胞数量I X IO7加入ImL裂解液，轻轻吹打充分重悬细胞，冰上裂解20min，13000rpm 离心20min，收集上清液，即HUVECs全蛋白样品，-20 °C储存，待测。
[0096] (2)western blot实验
[0097] ①根据目的蛋白的分子量，配置8%分离胶，灌胶至玻璃板的2/3处，然后胶上加一 层水封胶，静置，当水和胶之间有一条折射线时，胶已充分聚合，倒去上层水，用吸水纸将水 吸干。配置5%的浓缩胶，将剩余空间灌满，插入梳子，静置待胶聚合。将聚合后的胶放入电 泳槽，加入电泳缓冲液。
[0098]②拔掉梳子后，在加样孔中分别加入待检测蛋白样品（15yg/孔）。
[00"] ③电转条件:浓缩胶恒压90V，约20min;分离胶恒压160V，通过预染蛋白marker来 确定电泳停止时间。
[0100]④转膜:湿转法，转膜条件为，300mA恒流;0.45μπι孔径PVDF膜，转膜时间IOmin。转 膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。
[0101]⑤封闭：将膜完全浸没于3%BSA-TBST中，水平摇床孵育30min。
[0102] ⑥一抗孵育：3%BSA_TBST稀释一抗，HIF-Ia抗体（1:1000)，eN0S抗体（1:1000)， iNOS抗体（I: 1000)，VEGF抗体（I :2000) ,β-actin抗体(1:10000)4°C水平摇床孵育过夜。次 日洗膜，TBST洗5次，每次3min。
[0103] ⑦二抗孵育：5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP(l:10000)，室温 孵育40min。洗膜，TBST洗6次，每次3min。
[0104] ⑧显影与定影:ECL滴加到膜的蛋白面，反应3min;胶片曝光：IOs~5min(曝光时间 随不同光强度而调整），显影2min，定影。
[0105] ⑨图像分析：图片扫描后，用凝胶成像系统ver. 4.00(上海天能科技有限公司， Tanon 2500全自动数码凝胶成像分析系统）软件对图像进行分析。数据以X士s表示，采用 SPSS17.0统计软件进行分析。组间比较首先分析各组数据是否服从正态分布并检验方差齐 性，如服从正态分布且方差齐则进行One-Way ANOVA Dunnett t-test单侧检验。如果方差 不齐，进行对数转化后，再进行方差分析。
[0106] 实验结果参见图4~7。由图可知，与空白组相比，模型组HUVECs的VEGF增加，无显 著性差异，HIF-IcuiNOS的表达显著增加，eNOS的表达显著减少(P〈0.05)，给予天麻素(Gas) 和薯蓣皂苷元(Dio)的组合物后，VEGF、HIF-la、iNOS的表达显著减少，eNOS的表达显著增加 (Ρ〈0·05)。
[0107] 由上述实验结果可知，本发明的天麻素与薯蓣皂苷元的组合物可以降低缺氧 HUVECs早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例，增加正常细胞的比例；尤其是当天麻素与薯蓣皂 苷元的比例8:2时，可以显著降低缺氧HUVECs早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例，增加正常细 胞的比例。氧化应激在中枢神经系统退行性疾病的病理进程中发挥着重要的作用，缺氧导 致的氧化还原失衡会诱导内源性ROS(包括O 2'过氧化氢及羟化物等）的产生，一旦体内过 氧化物清除系统的清除能力低于ROS的产生速度，ROS的堆积会导致细胞毒性，诱导细胞凋 亡或退化。eNOS正常状态下仅产生少量的Ν0,可调节神经系统的功能；当细胞处于缺氧状态 时，iNOS的表达增加，产生大量NO，诱导VEGF的表达，最终导致血管新生。HIF-Ia作为血管生 成的刺激因子，在缺氧条件下表达显著增加，血管生成增加，可部分恢复缺血部位的供血情 况，在缺氧适应方面发挥重要作用，而HIF-Ia-旦过度表达，会导致血管生成过度增加，不 利于缺氧的恢复，对病理性部位造成进一步损伤。在给予本发明的组合物后，HIF-Ia和VEGF 表达降低，表明其能够有效控制血管新生，避免血管新生过度造成的不良影响;本发明的组 合物可以降低缺氧HUVECs中iNOS的表达，增加 eNOS的表达，使二者趋于正常水平，表明本发 明的组合物能够通过调控氧化应激水平，降低细胞内ROS的含量，使细胞氧化还原处于平衡 状态。因此，本发明的组合物可以降低缺氧HUVECs的凋亡，控制缺氧造成的血管新生，并且 通过调控氧化应激，使缺氧细胞的氧化还原恢复正常水平。
[0108] 实施例1
[0109] 将23.5g天麻素、8.5g薯蓣皂苷元、818g淀粉、100g微晶纤维素和50g羧甲基淀粉钠 混合后，于压片机上压片为5000个片剂，每片药品含有4.7mg天麻素、1.7mg薯蓣皂苷元。 [0110] 实施例2 将20g天麻素、12g薯蓣皂苷元、818g淀粉、100g微晶纤维素和50g羧甲基淀粉钠混 合后，于压片机上压片为5000个片剂，每片药品含有4mg天麻素、Img薯蓣皂苷元。
[0112] 实施例3
[0113]将16g天麻素、16g薯蓣皂苷元、818g淀粉、100g微晶纤维素和50g羧甲基淀粉钠混 合后，于压片机上压片为5000个片剂，每片药品含有3.2mg天麻素、3.2mg薯蓣皂苷元。
[0114]本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技 术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
【主权项】
1. 一种血管保护药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的活性成分仅为天麻素 和薯蓣皂苷元，所述天麻素和薯蓣皂苷元的摩尔比为10~6:1~4。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述天麻素和薯蓣皂苷元的摩尔比 为10~7:1~3〇3. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述天麻素和薯蓣皂苷元的摩尔比 为 8:2〇4. 一种血管保护药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括摩尔比为10~6:1~ 4的天麻素和薯蓣皂苷元。5. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括摩尔比为10 ~7:1~3的天麻素和薯蓣皂苷元。6. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括摩尔比为8: 2的天麻素和薯蓣皂苷元。7. -种血管保护药物制剂，其特征在于，所述药物制剂含有根据权利要求1~6任一项 所述的药物组合物和药学上可接受的辅料，每单位剂量的药物制剂中包括2~10mg天麻素 和0.1~5mg薯截阜苷元。8. 根据权利要求1~6任一项所述的药物组合物在制备血管保护药物制剂中的用途。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的血管保护剂用于在缺氧状态下控制 血管新生。10. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的血管保护剂通过降低缺氧诱导因 子HIF-la和血管内皮生长因子VEGF的表达来控制血管新生。
【文档编号】A61K31/7034GK106074581SQ201610515787
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】李志勇, 叶田园, 李彦文
【申请人】中央民族大学