载体。通过畸胎瘤形成测定，证实了人类iPSC细胞系具有多 能性。
[0096] hiPS细胞向具有眼区特性的神经上皮样结构的分化
[0097] 因为iPS细胞分化的必要条件是关闭自我更新机制，所以从培养基中去除FGF2,以 刺激融汇的iPS细胞的自发分化。如Greber et al. (2011)在人类ES细胞中所精确证明的， FGF2从培养基中的收回还可能促使神经外胚层的诱导。为了有利于hiPS细胞向神经外胚层 谱系的这种分化，将集落培养在包含DMEM/F12培养基的促神经培养基中，该DMEM/F12培养 基具有i^MEM非必需氨基酸和1%N2补充物(图2A)。这导致在4天内出现色素集落。在7天之 后，开始出现相光结构，近似超过色素细胞斑块的一半（图2B)。在两周内，所以这些结构都 组织成被色素细胞斑块部分环绕的神经上皮样结构（图2C)，对应于1~2个结构/cm 2。其它 色素集落不发育成神经上皮样结构，并且在无色素区域中很少观察到这些结构的形成。在 第14天，基于qRT-PCR的TaqMan探针显示，所有形成的神经上皮样结构都丢失了多能性相关 基因0CT4(P0U5F1)的表达，而获取了与眼区特化相关的转录因子（诸如LHX2、RAX、PAX6、 SIX3)的表达（图2D)。神经上皮样结构的免疫染色证明，所有细胞都共表达PAX6和RAX(图2E ~G)，具有眼区细胞的特征（(Mathers and Jamrich 2000)。几乎所有的细胞都是LHX2阳性 的（图2H、2J)，并且使用细胞增殖标记物Ki67证实了它们的祖细胞状态（图2H~JhqRT-PCR 进一步证明，MITF和VSX2的表达在第14天分别增加了 10倍和100倍（图2D)，其中MITF和VSX2 是在视泡/视杯形成过程中参与视网膜特化的两个转录因子(Horsford et al.2005)。免疫 组织化学显示出VSX2和MITF表达的相反梯度，在神经上皮样结构中具有VSX2的最强染色， 同时在该结构的外周色素部分中发现最强的MITF表达（图1K~0)。总起来讲，这些发现证 明，神经上皮样结构具有神经视网膜祖细胞典型的标记物表达谱，并且可被重命名为神经 视网膜(NR)样结构。有趣的是，qRT-PCR显示出早在培养14天之后，光感受器前体的转录因 子(诸如NRL和CRX)的表达就在NR样结构中增加了 5倍（图2D )，这暗示一些视网膜祖细胞可 能已经参与了光感受器谱系。
[0098] 基因表达分析显示出，在融汇的hiPSC培养物中，Wnt和BMP拮抗物、DKK1和NOGGIN 的外源表达，并且这两个基因在神经上皮样结构的形成过程中都被上调（图2P)。
[0099] 来源于hiPS细胞的视网膜祖细胞有效分化成视网膜神经元
[0100]在第14天，机械分离整个结构（图2C)，并且在3D搅拌下作为漂浮结构进行进一步 培养(图3A)，其中该整个结构对应于具有围绕的细胞色素斑块的NR样结构。在FGF2存在下， 培养漂浮的结构，以有利于神经视网膜的分化，而不是分化成RPE谱系（Fuhrmann 2010 ; Martinez-Morales et al.2004)。在分离之后一天（第15天），NR样结构已经形成了空心球 体，该空心球体的尺寸在培养中继续增大（图3B~D)。定量分析示出神经上皮的厚度在D17 至D24之间，从139± 19μπι增加到251 ±41μπι(图7)。发明人使用免疫组织化学和对从生长的 球体分离的RNA进行qRT-PCR，分析了特异性视网膜表型的时间过程和获取。从第14至42天 的分化过程中，仍然表达参与视网膜特化和分化的转录因子，诸如LHX2、RAX、S1X3、PAX6、 VSX2和MITF(图3E)。在第21天，表达VSX2的细胞位于NR样结构的正在发育的神经上皮中，而 MITF阳性细胞仅在该结构外周的RPE细胞中发现（图3G)。通过减少其mRNA在NR样结构中的 表达（图1E)，证明RPE细胞中的MITF表达受到限制。VSX2阳性细胞主要沿神经上皮的外部定 位，并且还表达PAX6(图3H) JAX6阳性/VSX2阴性细胞聚集在神经上皮的内部，这可能对应 于首先分化的视网膜神经元并且不携带增殖标记物Ki67。实际上，早在第21天，使用针对 BRN3A(图31)或钙网膜蛋白（CALRETININ)(图3M)的抗体在相同的内部位置中，通过免疫组 织化学鉴定出神经节细胞和无长突细胞。在正在发育的神经上皮中，还发现对应于分化的 水平细胞的LM1阳性细胞（图和神经源性分化蛋白（NEUROD)l的表达在漂浮培养 期间大大增加（图3E)，其中0TX2和NEUR0D1是编码参与诸如光感受器的视网膜细胞分化的 转录因子的两个基因 （Basset and Wallace 2012)。免疫组织化学分析示出，0TX2在结构外 周的RPE细胞中表达，并且0TX2阳性细胞出现在神经上皮中（图31 )，对应于光感受器的定向 前体(Nishida et al. ,2003)。通过qRT-PCR证实，NRL和CRX表达从第14天至第42天大幅增 加，从而证明分化成光感受器谱系（图3F和图6AKCRX阳性细胞早在第14天就可在神经上皮 中鉴定出来（图3J)，并且数量在第21天和第28天逐渐增加（图3K、图3L)。在这一阶段，通过 恢复蛋白（REC0VERIN)免疫染色鉴定出光感受器前体(图30)。
[0101] 在第21天，在神经上皮中出现共表达0TX2的CRX+细胞（图6C~H)。在第28天，CRX基 本表达在有丝分裂后的Ki67细胞中（图6M)。如预期的那样(Nishida et al.，2003)，0TX2+ 定向的光感受器前体不表达ΡΑΧ6(图6Ν)。所有这些数据证明，这些培养条件允许hiPS细胞 在3周内分化成主要类型的视网膜细胞(神经节细胞、无长突细胞/水平细胞和光感受器）。 此外，当对比两个不同的非整合hiPSC细胞系(hiPSC-Ι和hiPSC-2)时，这里开发的方案示出 良好的重复性(图8)。
[0102] 由hiPS细胞生成RPE细胞
[0103] 假定从在促神经培养基中培养的融汇hiPS细胞快速出现细胞色素斑块，发明人试 图分离它们并且使它们分化成RPE细胞。在第7天至第14天之间，细胞的色素斑块经机械选 定，并且重新铺在经明胶包被的平板上进行扩增（图4A)。在三周至一个月之后，它们形成融 汇的细胞单层，该融汇的细胞单层示出RPE细胞典型的鹅卵石形态（图4B~4C)。大部分细胞 对于关键的RPE特异性转录因子MITF是具有免疫活性的，并且细胞与细胞的界面通过Z0-1 排列，其中Z0-1是视网膜色素上皮细胞紧密连接的标记物（图ADhqRT-PCR分析(对成体人 类RPE细胞进行标准化)证明，在几次传代之后，hiRPE细胞保持与成熟RPE相关的标记物(诸 如MERTK、RPE65、BEST 1和PEDF)的表达（图4E)。为了确定hiRPE细胞是否有功能，测试了它们 进行FITC标记的光感受器外节(P0S)的吞噬作用的能力。检测到显著的吞噬活性，像对照的 RPE-J细胞系一样有效，其中对照的RPE-J细胞系在3小时内具有平均30%的内在化的P0S (图 4F)。
[0104] 实施例2:视网膜祖细胞向晚生(late-born)的视网膜细胞类型的分化
[0105] 如由qRT-PCR所证明的，在漂浮的培养物中持续维持分离的NR样结构，允许RPC进 一步分化成晚生的视网膜细胞类型（图9A~9E)。实际上，在首先表达了成熟的RGC细胞 (BRN3A和BRN3B)、无长突细胞(钙网膜蛋白和GAD2)和水平细胞(LIM)的早生视网膜标记物 (图9A和图9B)之后，观察到晚生的视网膜细胞类型的标记物的出现，对应于视锥细胞(R/G 0PSIN、BLUE OPSIN和CONE ARRESTIN)和视杆细胞光感受器(RH0D0PSIN和REC0VERIN)(图9C 和图9D)、双极细胞(PKCa)和Miiller胶质细胞(GLAST1)(图9E)。在第21天（图9F)至第42天 (图9G)之间，大部分NR样结构丢失了它们的片状外观，并且发育出含有0TX2+、CRX+和 REC0VERIN+细胞的内部玫瑰结，对应于分化的光感受器（图9G，图9J~9L和图6F~6H)，被表 达RGC细胞(BRN3A和CALRETININ)、无长突细胞(CALRETININ和AP2)和水平细胞(UM)的不同 标记物的细胞包围（图9G~J)。有趣的是，在第42天，REC0VERIN+细胞表达细胞表面标记物 CD73(图9L)，其中细胞表面标记物CD73是对用于移植的光感受器前体进行细胞分选的标记 物(Eberle et al.，2011)。在第77天，PAX6仅存在于有丝分裂后的细胞(KI67-)中的玫瑰结 外部，这与它在RGC、无长突细胞和水平细胞中的表达一致（图9M)。到第112天之前， RH0D0PSIN和R/G视蛋白（OPSIN)出现在NR样结构中，这反映出视杆细胞和视锥细胞的成熟 (图9N)。在第112天，REC0VERIN+和RH0D0PSIN+细胞通常位于剩余的玫瑰结的最内部（图10A 和图10B)。有趣的是，使用连接纤毛标记物微管蛋白（TUBULIN)进行免疫组织化学显示出， 在与REC0VERIN+细胞并列的玫瑰结的内腔区域中存在很薄的结构，这暗示形成了潜在的纤 毛和光感受器外节（图10C和图10D)。两种其它晚生的视网膜细胞类型，双极细胞和Miiller 胶质细胞的分化也需要较长时间的培养（112天），要分别通过PKCa染色（图9P)和通过谷氨 酰氨合成酶(GS)和S0X9的共表达（图9Q)进行检测。因此，这些细胞培养条件允许从NR样结 构中存在的RPC，以顺序的方式生成所有的视网膜细胞类型。
[0106] 实施例3:通过Notch抑制来加速光感受器前体的生成
[0107]使用抗CRX和REC0VERIN的抗体进行的免疫组织化学分析证明，光感受器前体的数 量在第14天（图3J)至第28天（图3L、图5B)之间逐渐增加。在第21天至第35天之间，NR样结构 丢失了它们的层状结构，并且发育出含有CRX和REC0VRIN阳性细胞的内部玫瑰结（图5B)。有 趣的是，在第21天，持续添加7天Notch抑制剂DAPT，足以显著增加 CRX阳性细胞和RE⑶VRIN 阳性细胞的数量（图5B)。从第28天至第35天，使用DAPT进行的后续处理也导致表达CRX和 RECOVERIN的细胞数量大大增加（图5B)。在第21天至第28天之间，使用DAPT处理一周能提高 光感受器前体的生成，因为与对照相比，第28天的CRX+和RECOVRIN+细胞的数量分别增加2.2 倍和2.6倍（图5C)。同时，第28天的处理之后，在第28天通过Ki67染色评估的有丝分裂的祖 细胞群体大大减少(3倍）（图5C)。在第28天至第35天之间，也评价了Notch抑制的效果，而不 是持续暴露于DAPT，因为在DAPT处理之后，在第28天仍然维持少量的RPC。在这些条件下， Notch抑制还导致NR样结构内的光感受器前体数量增加，即在第35天，CRX+和REC0VRIN+细胞 的数量分别增加了 1.7倍和4.1倍（图f5D)。有趣的是，在DAPT处理之后的该时间，可清楚地鉴 定出视锥细胞(CONE)-ARRESTIN+细胞(正常在第35天检测不到）（未示出）。此外，qRT-PCR分 析证实，在DAPT处理之后，在第35天，CONE-ARRESTIN表达增加，同时没有观察到RH0D0PSIN、 BLUE OPSIN(蓝视蛋白）或G/R OPSIN基因表达的显著变化（图5E)。在DAPT处理之后，降低了 GLAST1的表达（图5E)。
[0108] 这些发现证明，Notch信号传导减缓了从hiPS细胞的光感受器分化，如最近对于 hES细胞所提出的(Nakano et al. 2012)，因此它的抑制有利于光感受器分化并且加速了从 多能性RPC生成光感受器前体。
[0109] 实施例4:讨论
[0110] 本研究示出，在无血清的促神经培养基中进行融汇hiPSC的简单培养的新发现足 以在2周内生成NR样结构和RPE细胞。本文中描述的过程避免了以下步骤:EB的形成和选择； 添加诱导分子，诸如DKK1、N0GGIN和WNT和/或基质胶；以及EB涂敷在附着基质上。早期生成 的结构存在通过PAX6和RAX的共表达显示的0V表型，以及VSX2和MITF在神经上皮和RPE之间 的相对梯度。这种效率可能部分是由于:融汇的hiPSC内源性产生的DKK1和NOGGIN增加，其 中DKK1和NOGGIN是神经和视网膜特化的两种诱导因子，通常添加它们用于hESCS或hiPSC的 视网膜分化(Meyer et al.，2011;Boucherie et al.，2013)。然而，之前的研究报道了添加 至培养基或存在于基质胶中的IGF-I可将hESC导向视网膜祖细胞(Lamba et al.，2006;Zhu et al.，2013)，这暗示已经存在于N2补充物中的胰岛素足以在上述条件下起到类似作用。
[0111] 分离的hiPSC来源的NR样结构的漂浮培养物，允许RPC以与脊椎动物体内的视网膜 发生(retinogenesis) -致的顺序方式，分化成所有的视网膜细胞类型，这证明了hiPSC来 源的RPC的多能性。有趣的是，发明人还报道了，当RPC用于光感受器谱系时，抑制Notch的途 径明显提高了N