Zenith)上。细胞常规孵 育在37°C，标准5%C0 2/95%空气的培养箱中。该培养基被称为"iPS培养基"。在立体显微镜 (Vision Engineering Ltd)下，一星期对细胞进行人工传代一次。
[0066]人类成纤维细胞的重编程
[0067]使用如上述的游离体方法(Yu et al.，2009)，进行重编程。简单来讲，经由核转染 (Nucleofector 4D，V4XP，使用DT-130程序，Lonza)，将基于oriP/EBNAl 的游离体载体 PEP4E02SEN2K(质粒20925，Addgene)、pEP4E02SET2K (质粒20927，Addgene)和pCEP4-M2L(质 粒20926、Addgene)共转染到AHDF中。将转染的成纤维细胞（10 6个细胞/核转染)直接铺在3 X 10-cm接种了MEF的平皿(5 X 106个细胞/cm2)的"成纤维细胞培养基"中。在转染后第4天， 将"成纤维细胞培养基"替换成"iPS培养基"，该"iPS培养基"补充有被描述为增加重编程效 率的分子（Zhang et al.2013):500yM 丙戊酸（Sigma,法国），0·5μΜ PD-0325901(Selleck, Euromedex，法国）和2μΜ SB431542(Selleek)。在14天之后，将细胞单独培养在"iPS培养基" 中。在30天至40天，切割致密的细胞团，并且转移到60mm器官型细胞培养皿(Dutscher，法 国）中。在立体显微镜下，按照它们的人类ES细胞样集落形态拾取显现的hiPS集落。将它们 展开在如上所述的经丝裂霉素 C失活的MEF滋养层上，用于后续的特化。通过如下所述的 PCR，实现游离体载体的完全丢失和重编程基因的非整合。
[0068]游离体载体的PCR分析
[0069] 使用Nucleospin质粒快速纯化试剂盒(Macherey-Nagel，法国），按照制造商的方 案从hiPS细胞纯化游离体DNA。使用苯酚/氯仿提取方法，提取基因组DNA。如Yu et al. (2009)所清楚报道的，由于纯化方法的性质，基因组纯化DNA很可能被来自同一细胞的残留 量的游离体DNA污染，而且，纯化的游离体DNA同样也被少量的基因组DNA污染。PCR反应使用 Go Taq flexi聚合酶(Promega,法国）进行。对于每一个PCR反应，都添加从104个细胞中提 取的1〇μ1基因组DNA或游离体DNA(相当于含有100ng)作为模板。PCR混合物含有IX Go Taq Flexi缓冲液、2mM MgCl2、0.2mMdNTPs、0.5μΜ每一种引物和1.25U聚合酶，PCR以以下程序进 行:94°C初始变性lmin; 94°C保持45sec，60°C保持30sec，72°C保持lmin，进行35个循环;接 着72°C保持5min。来自天然成纤维细胞的游离体DNA和基因组DNA用作阴性对照，而基于 oriP/EBNAl的游离体载体(参见上述Yu et al.2009)用作阳性对照。
[0070] 染色体组型分析
[0071] 活跃生长的hiPS细胞集落（80%细胞覆盖）在37°C，经秋水仙素（20mg/ml， Eurobio，法国）处理90min。使用0.05%胰蛋白酶-EDTA离解细胞，然后在37°C，在75mM KC1 (Sigma Aldrich)中孵育10~14min，接着用3:1的甲醇/冰醋酸固定。为了进行mFISH染色体 组型分析，经固定的细胞在37°C，与变性的"鸡尾酒绘画（cocktail painting)mFISH"探针 (MetaSystems，Altussheim，德国）杂交过夜。在IX SSC和0.4X SSC的连续浴中清洗载玻片， 并且使用250ng/ml二脒基苯基吲噪(DAPI)对核进行染色。使用Cy5MetaSystems B-tect检 测试剂盒(MetaSystems)，使生物素化的探针显现出来。使用蔡司（Zeiss)Zl荧光显微镜捕 获十至二十个细胞分裂中期，该Zeiss Z1荧光显微镜配备有UV ΗΒ0 100-W灯，联接至 AxioCam相机(Carl Zeiss，法国）。使用MetaSystems Isis软件(MetaSystems)，对所有分析 的细胞分裂中期进行染色体组型分析。
[0072] 碱性磷酸酶(AP)染色
[0073] 在室温，使用95%的乙醇对培养在MEF上的人类iPS细胞固定10min。然后，使用roS 冲洗细胞，并且在室温，与在具有5mM MgCl2和0.05%吐温〇￥6〇11)-20的？!19.5的1^8缓冲 液中的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)和氮蓝四唑(NBT) (Roche，法国）的混合物孵育 5min至10min。染色之后，使用PBS冲洗细胞，之后在明视野显微镜下观察。
[0074]拟胚体的形成和分析。
[0075] 在立体显微镜(Vision Engineering Ltd.)下，从MEF层机械分离人类iPS细胞集 落，然后以悬浮液形式培养在超低吸附培养皿(Nunc,Dutscher,法国）内的ReproStem培养 基中。每隔两天换一次培养基，并且将EB培养2周，之后提取RNA或进行免疫组织化学分析。 [0076]视网膜分化
[0077]使人类iPS细胞展开覆盖在iPS培养基中的经丝裂霉素-C失活的小鼠 MEF滋养层 上。此时，限定为第0天，将融汇的hiPS细胞培养在没有FGF2的iPS培养基中。2天之后，将培 养基换成"促神经培养基"，该促神经培养基由杜氏改良伊格尔培养基:营养物混合物F-12 (DMEM/F12，1:1，L-谷氨酰胺）、1%MEM非必需氨基酸和1%N2补充物（Life technologies) 构成。每隔2~3天，更换一次培养基。在第14天，分离鉴定出的被色素细胞围绕的神经上皮 样结构，并且在开始两天中，将上述神经上皮样结构置于3D Nutator振动器(VWR，法国）的 24孔板中，使用补充有10ng/ml FGF2的"促神经培养基"，作为漂浮结构（3D)单独培养，并且 每隔2~3天更换一次培养基。当在振动器平台上培养时，分离的结构维持悬浮在培养基中， 并且通常不能附着至培养板的底部。在第19、20或21天，去除FGF2,并且每隔2~3天更换一 半的"促神经培养基"，持续接下来的几周。
[0078]对于RPE细胞培养物，在第7至14天之间，切割已鉴定出的没有非色素出芽结构 (budding structure)的色素斑块(pigmented patch)，并且转移至经0· 1%明胶包被的板 上(标作P〇) JPE细胞在"促神经"培养基(参见上文）中展开，并且每隔2~3天更换一次培养 基，直至细胞融汇。细胞在0.05 %胰蛋白酶-EDTA中解离，并且接种在新的经明胶包被的板 上(被认为是第Ρ1代）。
[0079] RNA提取和Taqman测定
[0080] 使用Nucleospin RNA II试剂盒(Macherey-nagel，法国），按照制造商的方案提取 总RNA，并且仅用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific,法国）检验RNA的产量和质量。 使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)，遵循制造商的建议，由500ng总RNA合成cDNA。然 后，将合成的cDNA以1/20稀释在无脱氧核糖核酸酶(Dnase)的水中，然后进行定量PCR。使用 定制的TaqMan?_Array 96-Well Fast(阵列96孔快）板和TaqMan?Gene expression Master Mix(基因表达主混合物）(Applied Biosystems)，遵循制造商的说明书，在Applied Biosystems的实时PCR系统(7500Fast System)上进行qPCR分析。用于扩增的所有引物和标 记有FAM的MGB探针都购自Applied Biosystems(Life Technologies，法国）。结果针对18S 进行标准化，并且在三次独立实验中，基因表达的量化基于△ Ct法进行。来自人类成体RPE 细胞的对照RNA对应于在小窝水平，分离自解剖的视杯的RPE细胞。
[0081]冷冻切片、免疫染色和图像的获取
[0082] 对于冷冻切片，视网膜样结构在4°C，4%多聚甲醛(PFA)中固定15min，并且在roS 中进行清洗。结构在4°C，在PBS/30 %蔗糖（Sigma)溶液中孵育至少2小时。将结构包埋在 PBS、7.5%明胶(Sigma)、10%蔗糖溶液中，并且在-50°C在异戊烷中冷冻，并收集ΙΟμπι厚的 冷冻切片。
[0083]如之前所述(Roger et al.2006)，对切片进行免疫荧光染色。简单来讲，载玻片在 室温与封闭溶液(PBS，0.2 %明胶和0.25 % Triton X-100)孵育lhr，然后在4°C与一抗(参见 表2)孵育过夜。载玻片在具有Tween 0.1%的PBS(PBT)中清洗三次，然后与适当的二抗孵育 1 小时，该适当的二抗缀合有AlexaFluor 488或AlexaFluor 594(Life Technologies)，并 且以1:600稀释在具有1:10000DAPI的封闭缓冲液中。使用配备有CCD CoolSNAP-HQ相机 (Roper Scientific)的DM6000显微镜（Leica)，或使用配备有405、488和543nm激光器的 Olympus FV1000激光共聚焦显微镜，来捕获荧光染色信号。使用1.55或0.46μπι步长来获取 激光共聚焦图像，并且每次获取是2~4个叠层或4~8个光学切面的投影。
[0084]
[0085]
[0086] 表2、用于免疫组织化学分析的抗体的列表
[0087] 畸胎瘤形成的测定
[0088]如之前所述的(Griscelli et al.，2012)，使用略微改变进行畸胎瘤形成测定。简 单来讲，将1X106至2X106个细胞注射到6周龄NOD Scidy (NSG)小鼠 （Charles River)的后 腿肌肉中。在9周至10周之后，对畸胎瘤进行解剖，并且在4%多聚甲醛中进行固定。然后，将 样品包埋在石蜡中，使用苏木精和曙红对切片进行染色。
[0089] 吞噬测定
[0090] 从猪眼中提纯光感受器外节(P0S)，并且按照建立好的程序（2)，通过与0.1mg/ml FITC(同分异构体-1)孵育而用荧光染料进行共价标记。将第3代的RPE-J(永生化的大鼠 RPE 细胞系)和第1代的hiRPE细胞放置于96孔组织培养板的各个孔中。每一孔都分层堆积有100 μL含有1X106个P0S颗粒，并且在32°C(RPE-J)或37°C(hiRPE)孵育3小时，之后使用含ImM MgCl 2和0.2mM CaCl2的rosO^BS-CM)冲洗孔三次。对于内在化颗粒独有的检测，通过在roS- CM的0.2%台盼蓝中孵育lOmin，对表面结合的FITC-POS的荧光进行选择性淬火，然后进行 细胞固定。通过在冰冷的甲醇中孵育5min，使细胞固定，然后再水合，并且在室温与DAPI孵 育lOmin。使用Inf inite MlOOOPro(Tecan)酶标仪(plate reader)，对焚光信号进行量化。 RPE-J细胞系用作吞噬活性的阳性对照，而hiRPE细胞在不存在P0S的情况下用作阴性对照。 [0091 ]统计分析
[0092] 使用非参数弗里德曼检验(non parametric Friedman test)，然后进行多恩多重 比较检验，或对所有的成对分析都使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test) (Prism 6， GraphPad软件），来进行方差分析。P〈0.05的值被认为在统计学上是显著的。
[0093] 1.2结果
[0094] 人类无整合iPS细胞的生成和特化。
[0095] 使用编码0(^4、嫩勵6、3(^2、1^呢8、1(1^4和〇1^(：的三种质粒对成体人类真皮成纤 维细胞(AHDF)进行共转染，其中这三种质粒对应于之前Yu et al. (2009)所述的质粒载体。 在之前被描述为加速重编程过程且降低游离体载体的丢失(Zhang et al.2012)的小分子 的存在下（图1A)，将转染的成纤维细胞培养在"iPS培养基"中。在转染后第30至40天之间， ES样集落首先变得近似可见，具有紧凑排列的穹状结构（图1B)。当拾取和展开时，这些hiPS 细胞集落示出典型的人类ES细胞的形态。这些hiPS细胞的分析证明，克隆发展出碱性磷酸 酶(AP)活性，同时表达多能性标记物Nanog、TRA-1 -81、0CT4和SSEA4(图1C~E)。基于qRT-PCR的TaqMan探针显示，表达多能性基因在各成纤维细胞群上都显著增加，并且与在人类ES 细胞中所看到的相当（图11)。如基于qRT-PCR(图1J)的TaqMan探针和在培养两周之后对拟 胚体进行免疫组织化学（图1F~H)所观察到的，iPS集落可在体外分化成所有三个胚层的衍 生物。此外，人类iPS细胞系显示出正常的染色体组型（图1K)。如对游离体中的OriP位点进 行的RT-PCR分析（图1L)所证明的，hiPS细胞没有示出转基因的基因组整合，并且在15次传 代之后，已经完全丢失了游离体