专利名称：：一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种由水泡性口炎病毒(VSV)引起疾病的检测方法，尤其是提供了一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法，同时还公开了其制备方法，属于疾病检测
技术领域：
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背景技术：
：水泡性口炎(Vesicularstomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)引起的一种急性、热性、高度接触性的人畜共患传染病。以在口腔粘膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮出现水泡为特征，现已成为世界范围内A类人兽共患病。目前，常规的VSV检测技术主要有病毒分离鉴定、中和试验、补体结合试验、琼脂扩散试验等。上述方法在用于临床上快速、准确地诊断该病时都存在着不同程度的缺陷，不适于现场检测。因此，研究一种简单、快捷的VSV检测方法具有十分重要的意义。
发明内容本发明目的在于提供一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条，具有特异性强、灵敏度高、简单、快速等特点。本发明提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。本发明提供的水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条，它包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线、质控线。其中金标垫包被有纯化的VSV-G蛋白胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的VSV抗原，质控线包被有兔抗VSV高免血清，质控线一侧贴有吸收垫。本发明水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤(1)VSV的增殖和纯化将VSV病毒接种长满单层的BHK-21细胞，细胞达80%时，收获细胞培养病毒液，反复冻融2次后，用差速离心及不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒；(2)VSV多克隆抗体的制备将纯化的VSV分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等比例混合乳化后作为免疫原，免疫家兔，待抗体效价达到IO5时，用非乳化抗原加强免疫一次3d后兔颈静脉放血分离血清；应用A-Sepharose亲和层析法纯化血清IgG，-20°C保存备用；(3)VSV-G蛋白的原核表达与纯化提取纯化VSV的RNA，扩增VSV-G蛋白基因片段，构建重组表达质粒PGEX-G，并在大肠杆菌中诱导表达，利用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达的蛋白；(4)胶体金溶液及金标蛋白的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，确定胶体金与VSV-G蛋白用量比例，制备金标VSV-G蛋白偶联标记物，采用低温超速离心法纯化金标VSV-G蛋白；(5)试纸条的组装将金标VSV-G蛋白用喷点仪喷点玻璃纤维素膜，纯化的VSV和VSV高免血清IgG分别喷涂于硝酸纤维膜检测线和质控线上，将处理好的硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫等材料按顺序进行粘贴、组装、切条、密封，4°C保存。本发明抗体胶体金检测试纸条的使用方法1.用1.5ml样品管，采血0.5Iml待检测血清自然析出或用离心机离心10分钟左右，使血清析出。2.将试纸条垂直插入含血清样品100150ul的离心管中，注意不要超过样品垫1，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。结果判断1.阳性在检测线和质控线处，各出现一条红色条带，判定为阳性；检测线条带色泽的深浅，依检测样品中VSV抗体效价的高低而变化，效价越高色带越深，反之越浅。2.阴性在质控线出现一条红色条带，检测线未出现一条红色条带，说明检测样品中无VSV抗体存在。3.无效仅在检测线显色或在检测线和质控线均无明显条带出现，视为试纸条检测无效(图2)。本发明试纸条特异性试验用本发明试纸条对水泡性口炎病毒(VSV)阳性血清、羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(Orf-V)阳性血清、狂犬病病毒(RV)阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清及猪水疱病病毒(SVDV)阳性血清进行检测。结果仅VSV阳性血清出现明显的检测线和对照线，其余血清检测均为阴性。说明该试纸条具有很好的特异性。本发明试纸条敏感性试验将高免阳性血清作1100倍稀释后，按2倍进行递减稀释，然后进行检测。结果同一份VSV阳性高免血清，间接ELISA检测，最低检出量为11600-3200，用本发明试纸条(GICA)进行检测，最低检出量为11600。本发明胶体金免疫试纸条敏感性比ELISA低一个稀释度。本发明试纸条符合率试验将本室保存的484份临床血清样本分别用本发明的试纸条和ELISA法进行平行检测，结果如表1所示，本发明的试纸条相对ELISA实验的符合率为98.35%，特异性为96.22%，敏感性为98.94%。表1试纸条和ELISA对临床样本检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本发明试纸条保存期试验2009年1月以来对保存的试纸条进行了试验，结果表明，4°C保存的试纸条有效期为12-18个月。本发明试纸条的有益效果在于VSV抗体胶体金检测试纸条具有特异性强、敏感性高、操作简单快捷的优点，易于推广，适用于基层检测，具有广阔的市场前景。图1:VSV抗体检测试纸条结构示意图；图2=VSV试纸条检测结果判定。具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1VSV多克隆抗体的制备及VSV-G蛋白的原核表达1.VSV的增殖和纯化采用单层吸附接毒法，待BHK-21细胞长成单层后，倾弃生长液，加入VSV，37°C吸附lh，加2%维持液，37°C静置培养，待细胞有75%以上出现病变时即可收毒，放入到-20°C冰箱中，反复冻融23次。将病毒液放入到无菌的离心管中，6000r/min，4°C离心30min，取上清，再进行30000r/min，4°C离心3h，用适量PBS溶解沉淀，应用不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒。2.制备兔抗VSV高免血清及纯化将纯化的VSV分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等比例混合乳化后作为免疫原，首免用弗氏完全佐剂乳化的抗原进行，以后每间隔两周加强一次免疫，换用弗氏不完全佐剂乳化的抗原。分别在3免和4免后第10天用全病毒建立的ELISA方法检测小鼠抗体效价，当抗体效价达到IO5时，用非乳化抗原加强免疫一次(与上次免疫相隔2周以上)，3d后兔颈静脉放血分离血清。应用A-Sijpharose亲和层析法纯化血清IgG，_20°C保存备用。3.原核表达VSV-G蛋白(1)RNA的提取及基因的RT-PCR扩增用Trizol法提取纯化VSV的RNA。根据国外Genbank已发表的VSV的核苷酸序列(序列号为AF473864)设计引物，扩增VSV-G蛋白基因片段。(2)克隆及鉴定将PCR扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒回收，并将回收的DNA片段与pMDIS-T载体16°C连接过夜，将重组子pT-G转化大肠杆菌JM109感受态细胞，氨苄抗性平板筛选后摇菌，提取质粒，NcoI/XhoI双酶切鉴定。将鉴定为阳性的重组菌命名为PMD18-G。(3)重组表达载体的构建与鉴定提取pMD18-G和pGEX_4T_l质粒，用EcoRI、BamHI进行双酶切后回收，将酶切载体与目的片段用T4DNA连接酶连接，转化BL21(DE3)感受态细胞，提取阳性克隆质粒，进行PCR和EcoRI.BamHI双酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pGEX-G，送公司测序。(4)重组蛋白的诱导表达及纯化将鉴定为阳性的重组表达菌pGEX-G接种于含氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养OD6tltlnm值为0.60.8后(约3h)，加IPTG至终浓度为lmmol/L诱导培养，同时设空载体对照。收获诱导46h的菌液，离心后用0.5MnaCl、20mMTris-Cl(PH=7.6)洗两次，然后用PBS(0.01M,PH7.4)悬浮。利用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达的蛋白，紫外分光光度计测定其纯度。实施例2VSV抗体胶体金检测试纸条的制备1、胶体金颗粒的制备取氯金酸溶液Iml加99ml超纯水成终浓度0.01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取柠檬酸三钠Iml—次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却后4°C保存。吸取少量样品用透射电镜观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均勻，直径约40nmo2、免疫胶体金复合物的制备目测法确定胶体金与VSV-G蛋白用量比例。用0.lmol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至8.4，取11支洁净试管，每管分装胶体金溶液(lml/管)。将VSV-G蛋白逐级稀释后(由0.5yg5g另设对照管)，顺序加入一系列装有Iml胶体金的试管中混勻；5min后，在211管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混勻，室温静置2h以上观察结果；1号管既不加抗原也不加氯化钠溶液，为对照管；未加抗体的11号管也为对照；未加抗原及加入量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而抗原含量最低试管的蛋白量，即为稳定Iml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在胶体金标记VSV-G蛋白最低稳定量的基础上再加上10%即为稳定胶体金所需VSV-G蛋白的实际所需用量。取一定量的胶体金溶液，用0.IMK2CO3溶液调其pH为8.4，在磁力搅拌下，按最佳标记量逐滴加入VSV-G蛋白，继续搅拌20min，加入终浓度为1%的牛血清白蛋白(BSA)，再搅拌15min，置4°C冰箱保存备用。3、免疫胶体金的纯化采用低温超速离心法纯化金标VSV-G蛋白，以除去溶液中未标记的VSV-G蛋白和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。先将金标VSV-G蛋白在4°C下，3000r/min低速离心40min，小心吸取上清液，弃去沉淀；上清再以10000r/min4°C离心40min，弃去上清。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(内含1%BSA，0.02%叠氮钠)溶解沉淀至原体积，充分稳定后过夜。再以4°C10000r/min离心40min，弃上清液。用0.Olmol/L、pH7.4的PBS(内含BSA,0.02%叠氮钠)溶解沉淀至原体积的1/10，4°C贮存备用。4、试纸条的组装(1)将金标VSV-G蛋白用喷点仪(XYZ3000DispensingPlatform)喷点玻璃纤维素膜，室温条件下自然干燥，密封，4°C保存备用；(2)将纯化的VSV和VSV高免血清IgG用喷点仪分别喷涂于硝酸纤维膜检测线和质控线上，室温自然干燥后用脱脂乳封闭，37°C真空干燥，密封，4°C保存备用。(3)将处理好的硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫等材料按顺序进行粘贴、组装、切条、密封(图1)，4°C保存备用。权利要求一种水泡性口炎病毒抗体检测试纸条，由样品垫、金标垫、吸收垫、硝酸纤维素膜组成，其特征在于金标垫包被有纯化的VSV-G基因胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的VSV抗原，质控线包被有兔抗水泡性口炎病毒抗体，质控线侧贴有吸收垫。2.权利要求1所述水泡性口炎病毒抗体检测试纸条的制备方法，包括下述步骤(1)VSV的增殖和纯化将VSV病毒接种长满单层的BHK-21细胞，细胞达80%时，收获细胞培养病毒液，反复冻融2次后，用差速离心及不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒；(2)VSV多克隆抗体的制备将纯化的VSV分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等比例混合乳化后作为免疫原，免疫家兔，待抗体效价达到105时，用非乳化抗原加强免疫一次3d后兔颈静脉放血分离血清；应用A-S印harose亲和层析法纯化血清IgG，-20°C保存备用；(3)VSV-G蛋白的原核表达与纯化提取纯化VSV的RNA，扩增VSV-G蛋白基因片段，构建重组表达质粒pGEX-G，并在大肠杆菌中诱导表达，利用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达的蛋白；(4)胶体金溶液及金标蛋白的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，确定胶体金与VSV-G蛋白用量比例，制备金标VSV-G蛋白偶联标记物，采用低温超速离心法纯化金标VSV-G蛋白；(5)试纸条的组装将金标VSV-G蛋白用喷点仪喷点玻璃纤维素膜，纯化的VSV和VSV高免血清IgG分别喷涂于硝酸纤维膜检测线和质控线上，将处理好的硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫等材料按顺序进行粘贴、组装、切条、密封，4°C保存。全文摘要本发明提供一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条，它包含硝酸纤维素膜及其两端的金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有VSV-G基因胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的VSV抗原，质控线包被有兔抗VSV抗体，质控线侧贴有吸收垫。本研究将酶联免疫原理和胶体金层析技术结合，制备检测VSV抗体的胶体金试纸条，并拟应用于临床，提高VSV的防治能力，具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无须仪器设备或只需简单的仪器等优点，因此非常适于发病现场、门诊以及实验条件不具备的场所等临床样品检测使用。文档编号G01N33/569GK101833003SQ201010182429公开日2010年9月15日申请日期2010年5月26日优先权日2010年5月26日发明者孙晨,孙秀萍,宋德光,张巍,王丽,苏高莉,贺文琦,陆慧君,陈克研,高丰申请人:吉林大学