鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及人畜共患传染病病原体的检测技术领域，具体设及一种鹿布鲁氏菌病 胶体金抗体检测试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌表面蛋白 31 炬rucella cellsurface protein 31ku，BCSP31)基因于 1988年被克隆测序和体外表达，它编码了大小为31ku具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋 白质，除了绵羊附睾布鲁氏菌外，在其他6种布鲁氏菌中均可检测到BCSP31蛋白的表达。布 鲁氏菌BCSP31基因在8株不同属来源的布鲁氏菌菌株中同源性达99. 3%，是布鲁氏菌种属 特异性基因，具有高度保守性。
[0003] 目前，已有学者利用真核表达的方法表达了 BCSP31蛋白，并利用其真核表达产 物免疫小鼠，研究其在小鼠体内的抗布鲁氏菌感染的能力；也有学者利用原核表达载体 pGEX4p-l表达了 BCSP31蛋白，并研制了 BCSP31蛋白的单克隆抗体。
[0004] 胶体金是一种常用的标记技术，是W胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一 种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床 使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学W至生物巧 片中都可能例用到。
[0005] 目前，采用布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原用于鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试 纸条的研制还未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法，用 于快速筛查鹿血清或鹿全血中布鲁氏菌抗体。
[0007] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下；
[000引本发明提供的一种鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条，包括塑料卡、装在塑料 卡中的PVC底板、依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的NC 膜、吸水纸，所述NC膜的检测线和质控线上分别点样有抗原和二抗；所述抗原为1. 50mg/mL 的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白，所述二抗为0. 75mg/mL的兔抗鹿IgG。
[0009] 进一步的，所述金标结合垫通过W下方法制备：
[0010] (1)用抑9. 0的棚酸盐缓冲液将初始浓度2. 45mg/血的抗体蛋白稀释至终浓度 1. Omg/mL，用0. 1M的K2CO3溶液调节胶体金的抑为9. 0,胶体金粒径大小为30皿；W每1血 胶体金加40 y g抗体蛋白的比例，逐滴加入抗体蛋白，揽拌均匀后，常温下静止30min ;加入 10 % BSA至终浓度为1 %，继续揽拌15min ;加入3 % PEG2000至终浓度为0. 1 %，继续揽拌 15min，获得金标抗体溶液；
[OCm] (2)将步骤（1)获得的金标抗体溶液在4°C下，150化pm离屯、20min，去除沉淀，得 上清液；将上清液在4°C下，800化pm离屯、30min，弃上清，取流动的暗红色沉淀，重悬于上清 液初始体积1/10的储存液中，获得纯化的金标抗体溶液，4°c保存；
[0012] (3)将结合垫浸入0.01M的PBS缓冲液中，lOmin后取出，室温惊干，4°C保存；将步 骤（2)获得的纯化的金标抗体溶液滴加到上述结合垫上，直至结合垫饱和，37°C下干燥比， 获得金标结合垫。
[0013] 进一步的，步骤（1)中，所述抗体蛋白为兔抗鹿IgG。
[0014] 进一步的所述抗原和二抗的点样用量均为2yL/lcm。
[0015] 本发明还提供了上述鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法，该方法包 括W下步骤：
[0016] (1)用抑9. 0的棚酸盐缓冲液将初始浓度2. 45mg/血的抗体蛋白稀释至终浓度 1. Omg/mL，用0. 1M的K2CO3溶液调节胶体金的抑为9. 0,胶体金粒径大小为30皿；W每1血 胶体金加40 y g抗体蛋白的比例，逐滴加入抗体蛋白，揽拌均匀后，常温下静止30min;加入 10 % BSA至终浓度为1 %，继续揽拌15min;加入3 % PEG2000至终浓度为0. 1 %，继续揽拌 15min，获得金标抗体溶液；
[0017] (2)将步骤（1)获得的金标抗体溶液在4°C下，150化pm离屯、20min，去除沉淀，得 上清液；将上清液在4°C下，800化pm离屯、30min，弃上清，取流动的暗红色沉淀，重悬于上清 液初始体积1/10的储存液中，获得纯化的金标抗体溶液，4°C保存；
[0018] (3)将结合垫浸入0.01M的PBS缓冲液中，lOmin后取出，室温惊干，4°C保存；将步 骤（2)获得的纯化的金标抗体溶液滴加到上述结合垫上，直至结合垫饱和，37°C下干燥比， 获得金标结合垫；
[0019] (4) W 1. 50mg/mL纯化后的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原，W 0. 75mg/mL兔抗 鹿IgG为二抗，W 2 y L/lcm分别点样于NC膜的检测线和质控线上，室温固定化；将点样后 的NC膜浸入到0. 01M的PBS缓冲液中，37°C下封闭30min后，再用0. 01M的PBS缓冲液漂 洗NC膜表面，37°C下烘干，获得带有重组布鲁氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜；
[0020] 妨将步骤（4)获得的带有重组布鲁氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜粘贴 于PVC底板上，将步骤（3)获得的金标结合垫粘帖在NC膜左端，叠加2mm;将样品垫粘帖在 金标结合垫左端，叠加2mm;将吸水纸粘帖在NC膜右端，叠加2mm;用塑料卡固定后即获得 胶体金检测试纸条。
[0021] 进一步的，步骤（1)中，所述抗体蛋白为兔抗鹿IgG。
[0022] 进一步的，步骤（2)中，所述储存液为含有1% BSA和0. 05%阳G2000的PBS缓冲 液，浓度为0. 01M，抑为8. 5~9. 0。
[0023] 进一步的，步骤（3)中，所述PBS缓冲液中含有5%庶糖和0. 05%吐温-20。
[0024] 进一步的，步骤（4)中，所述PBS缓冲液中含有1 % BSA。
[0025] 进一步的，所述金标结合垫为玻纤膜，型号为化0194,长X宽=6mmX 5mm。
[0026] 进一步的，所述NC膜的型号为Vividl70,长X宽=25mmX5mm。
[0027] 进一步的，所述PVC底板的长X宽=60mmX 5mm。
[002引进一步的，所述样品垫为玻纤膜，型号为化0194,长X宽=20mmX 5mm。
[0029] 进一步的，所述吸水纸的型号为册076,长X宽=15mmX 5mm。
[0030]本发明的有益效果是：本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条由样品垫、 金标结合垫、NC膜、吸水纸、PVC底板和塑料卡组成，将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水 纸依次固定在PVC底板上，然后整体装在塑料卡中。通过将胶体金标记抗体蛋白（兔抗鹿 IgG)后得到的纯化的金标抗体溶液滴加到结合垫上形成金标结合垫；W布鲁氏菌BCSP31 蛋白为抗原，W兔抗鹿IgG为二抗，将浓度为1. 50mg/mL的布鲁氏菌BCSP31蛋白和浓度为 0. 75mg/mL的兔抗鹿IgG分别W2化/lcm点样于NC膜上，即将布鲁氏菌BCSP31蛋白喷涂 在检测线（T线）上，将兔抗鹿IgG喷涂在质控线（C线）上。
[0031] 本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条是基于间接胶体金免疫层析技术 实现的，检测时，样品中的布鲁氏菌抗体与胶体金包被的抗体蛋白结合形成抗体复合物，并 沿着试纸流向NC膜的另一端，当该抗体复合物流到NC膜上的T区时，固定在膜上的特异性 抗原即布鲁氏菌BCSP31蛋白捕获该复合物并逐渐凝集成一条可见的检测线订线），质控线 (C线）出现则表明免疫层析发生，即试纸有效；检测线（T线）出现则表明样品