L;调整pH至7. 6-7. 8。
[0172] 3)稀释液：用于标准品和待测样品的稀释，其配方为Na2HP04 · 12H20, 2. 9g; NaH2P04 ·2Η20,0· 296g;NaCl，8. 5g;Proclin300,0· 6mL;BSA，10g;胎牛血清，150mL;硫酸庆 大霉素，2支（8万单位/支）；双蒸水，定溶至100〇1^;调整？!1至7.6-7.8。过滤除菌，2-8 1€ 保存。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。
[0173] 4)洗涤液：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na2HP04 · 12H20 58g， NaH2P04 · 2H20 5. 92g，NaCl170g，Tween-205.OmL，Proclin3000. 6mL，用双蒸水定溶至 1000mL，调整pH值至7· 2-7. 4。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。
[0174] 5)显色液A:每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：无水乙酸钠4. 5g，冰醋酸1. 2mL， 过氧化脲〇. 8g，用双蒸水定溶至1000mL。
[0175] 6)显色液B:每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。显色液B配方为：柠檬酸1. 62g， EDTA-2NaO. 372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0. 50g，用双蒸水定溶至1000mL。
[0176] 8)终止液：每个试剂盒1瓶，711117瓶。配方为：100〇1^双蒸水中含有98%硫酸 27. 8mL〇
[0177] 9)标准口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒阳性血清：每个试剂盒1瓶，lmL/瓶。
[0178] 10)标准口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒阴性血清：样品稀释液可作为阴性血清使 用。
[0179] 实施例4、用单克隆抗体6D6anti、2H10anti及金标纸层析试纸（卡、盒）检测口蹄 疫0型（0/GX/09-7)病毒
[0180]1、制备金标纸层析试纸
[0181] 如图5、6所示（图5为金标纸层析试纸的正面结构图，图6为金标纸层析试纸的 纵截面结构图），用于检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的金标纸层析试纸由吸水垫1、硝 酸纤维素膜（NC膜）2、玻璃纤维膜样品垫3、玻璃纤维素膜结合物释放垫4组成，硝酸纤维 素膜2上设有检测线（T线）6和质控线（C线）5。
[0182] 金标纸层析试纸的制备方法包括以下步骤：
[0183] 1)包被硝酸纤维素膜（NC膜）2
[0184]用浓度为l_5mg/mL的单克隆抗体2H10anti包被检测线（T线），用浓度为l-5mg/ mL的羊抗鼠免疫球蛋白（购自京博尔西科技有限公司）包被质控线（C线）。具体操作为： 用BI0D0T公司XYZ3000喷膜机将用作包被抗体的单克隆抗体6D6anti(或2H10anti)、羊抗 鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜（购自Millipore公司）2上，形成 相互分离的检测线6和质控线5,质控线和测试线间距一般为0. 3-1. 0cm，优选0. 5cm，37°C 干燥1小时备用，37°C干燥1小时。
[0185] 2)结合物释放垫4的制备
[0186] 2. 1用胶体金标记单克隆抗体6D6anti，方法为：在磁力加热搅拌下，向三角瓶中 加入155mL纯化水，煮沸。加入1 %四氯化金溶液5mL，煮沸。再加入1 %柠檬酸三钠溶液 7mL，煮沸5分钟，即为胶体金溶液，冷却后保存于2-8°C。取1毫升胶体金溶液于离心管中。 加入15μ1 0. 2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μ1抗体，混匀后静置30min。加入 10μ1 20%BSA溶液，平衡5min。加入10μ1 20%PEG20000溶液，平衡30min;用离心机 lOOOOrpm，离心lOmin，去上清液。加入100μΙ金标复溶液（含有2%蔗糖、1%酪蛋白、 0· 5%BSA、0.ITritonΧ100、0· 1%SDS的硼酸缓冲液），复溶后备用。
[0187] 2. 2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上标记有胶体金 标记的特异性单克隆抗体6D6anti，将复溶后的金子用金标复溶液1:4稀释后按照8μ1/cm 的速度喷膜，37°C下放置2小时干燥，备用。
[0188] 3)制备金标纸层析试纸
[0189] 在PVC背板7上先黏贴硝酸纤维素膜2,在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸 水垫1，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫4和样品垫3,得到用于检测口蹄疫0型（0/ GX/09-7)病毒金标纸层析试纸，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。
[0190] 如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试剂盒，该试剂 盒对应于样品垫的部位设有点样口（图7中S处），对应于检测线和质控线的部位设有观测 窗（图7中C/T处）。
[0191] 2、金标纸层析试纸（卡、盒）的使用
[0192] 金标纸层析试纸条的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫3即吸取液体向 上端移动，流经结合物释放垫4时使干片上的胶体金标记单克隆抗体6D6anti复溶，并带动 其向硝酸纤维膜2渗移。若样本中有待测特异抗原（阳性样本），其可与胶体金标记单克 隆抗体6D6anti结合，此抗原抗体复合物流至检测线6即被固相抗体2H10anti所获，在膜 上显出红色检测线条（T线）。过剩的胶体金标记单克隆抗体6D6anti继续前行，至质控线 5与羊抗鼠免疫球蛋白（固相二抗）结合，而显出红色质控线条（C线）。反之，若样本中无 待测特异抗原（阴性样本），则无检测线条（T线），而仅显示质控线条（C线）。如果检测线 (T线）与质控线（C线）均不显色或仅检测线（T线）显色，则表示金标纸层析试纸（卡） 失效（图5)。
[0193] 金标纸层析测试卡和试剂盒的使用方法：检测时，取待检样品1-2滴，滴在试纸盒 的点样口，根据观测窗内的检测线（T线）和质控线（C线）是否出现色带来确定样品中是 否存在口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒。
[0194] 3、用金标纸层析试剂盒检测不同浓度的口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒
[0195] 用金标纸层析试纸盒（用胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti包被结合物释 放垫，用单克隆抗体2H10anti包被检测线（T线））检测不同浓度（浓度分别为120、60、30、 15、5ng/mL)的口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒，以检测试剂盒的灵敏度。
[0196] 检测结果显示检测灵敏度可达15ng/mL(参见图7)，表明该产品具有较好的灵敏 度，具有实际应用价值。
【主权项】
1. 一种检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的单克隆抗体组合，包括口蹄疫0型（0/ GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体2H10anti。2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体组合，其特征在于：所述特异性单克隆抗体 6D6anti其重链可变区具有序列表中SEQIDN〇:l的氨基酸残基序列或将序列表中SEQID No:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫0型 (0/GX/09-7)病毒特异结合的多肽，其轻链可变区具有序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残 基序列或将序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺 失或添加且可与口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒特异结合的多肽。3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体组合，其特征在于：编码特异性单克隆抗体 6D6anti的基因（6D6anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo:3的DNA序 列或编码序列表中SEQIDNo:1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo:3 限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo:4的 DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQID No:4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。4. 根据权利要求1至3任一所述的单克隆抗体组合，其特征在于：所述非特异性单克 隆抗体2H10anti的重链可变区具有序列表中SEQIDNo:5的氨基酸残基序列或将序列表 中SEQIDNo:5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口 蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒非特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中SEQIDNo:6的 氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo:6的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的 取代、缺失或添加且可与口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒非特异结合的多肽。5. 根据权利要求4所述的单克隆抗体组合，其特征在于：编码非特异性单克隆抗体 2H10anti的基因（2H10anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo:7的DNA序 列或编码序列表中SEQIDNo:5的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo:7 限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo:8的 DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:6的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQID No:8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。6. -种检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，包含权利要求 1至5任一所述的检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的单克隆抗体组合。7. 根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，具体包括用口蹄疫0型（0/ GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti作为包被抗体包被的微孔板，和用非特异性单 克隆抗体2H10anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。8. 根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述用6D6anti作为包被抗体包 被的微孔板指的是用10mMpH7. 0-7. 4PBS将6D6anti稀释成0. 5-10μg/mL，加入微孔板中， 110以1/孔，置于2-8°(：过夜；拍干后，加入含1%83八的101111?!17.0-7.4?83,30(^1/孔， 置于2-8°C过夜；拍干、干燥后真空装入铝箱袋中备用； 所述酶标抗体为用辣根过氧化物酶（HRP)或碱性磷酸酯酶（ALP)等标记2H10anti抗 体，然后用酶标记抗体稀释液（配方为：Na2HP04 · 12Η20,2· 9g;NaH2P04 ·2Η20，(λ296g;NaCl， 8. 5g;Proclin300,0· 6mL;BSA，lOg;胎牛血清，150mL;酶稳定剂，5g;Tween-200. 25mL;双 蒸水，定溶至l〇〇〇mL;调整pH至7. 6-7. 8)稀释成工作液，工作液的浓度为0. 1-1. 0μg/mL。9. 权利要求6或7或8所述口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的ELISA试剂盒的使用方 法，用于对口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的检测，包括以下步骤： 1) 用特异性单克隆抗体6D6anti包被微孔板，洗板； 2) 封闭经包被的酶联板，洗板； 3) 加待测样品，洗板； 4) 加辣根过氧化物酶（HRP)或碱性磷酸酯酶（ALP)标记的非特异性单克隆抗体 2H10anti，洗板； 5) 加底物显色； 6) 终止反应； 7) 测定0D45。值。10. -种检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的金标纸层析试纸，由玻璃纤维膜样品垫、 结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜（NC膜）组成，硝酸纤维素膜上设有检测线（T线）和 质控线（C线），其特征在于：用非特异性单克隆抗体2H10anti(浓度为l-5mg/mL)包被检 测线，结合物释放垫上包被有用胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti。
【专利摘要】本发明公开了检测口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体组合、ELISA试剂盒及金标纸层析试纸，该组合包括特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体2H10anti，在ELISA检测中以6D6anti作为包被抗体、以2H10anti作为酶标抗体，在胶体金试纸条中以6D6anti作为标记抗体，以2H10anti作为包被抗体可用于检测口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒，并具有高特异性、高灵敏度的优点，本发明将在口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的检测、疫苗生产、流行病学研究中发挥作用。CGMCC No.1119520150916
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/569, G01N33/558, C07K16/10
【公开号】CN105348386
【申请号】CN201510750749
【发明人】郑金来, 范秀丽, 刘国英, 吴园园, 路荣, 李蓉, 张妍, 郝金宝, 陈光达
【申请人】北京三联博悦生物技术有限公司, 金宇保灵生物药品有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月6日