反复进行多次，即将步骤(2)所得的乳液作为预乳液用压力再次通过微孔膜，直至得到的乳液的粒径大小与均一性满足要求。对于大多数体系而言，过膜次数为3-5次。
[0030]本发明的制备方法与现有技术相比，具有如下特点:
[0031](I)本发明提供的乳滴粒径均一、可控的油佐剂疫苗制剂制备方法，均一的乳液不仅储存稳定，大大减慢奥氏熟化进程，作为兽用疫苗制剂时，有效降低抗原在注射部位前2天的抗原释放，而后期抗原持续稳定释放，提升免疫应答水平和持续性。
[0032](2)本发明的W/Ο型疫苗油佐剂制剂，乳滴尺寸均一、可控，分散系数(PDI)小于0.1，乳液稳定性好，能够储存6个月以上；抗原能持续释放4周或更长时间。
[0033](3)本发明的W/Ο型疫苗油佐剂制剂的制备方法，可通过控制制备过程中的微孔膜孔径大小和操作压力来控制产品的粒径大小和均一性。
[0034](4)本发明的W/Ο型疫苗油佐剂制剂的制备方法，克服了现有技术制备的油佐剂乳液制剂粒径不均一、不可控的问题，保证了批次间产品的可重复性，特别是保障了抗原释放的可控性。
[0035](5)本发明方法制备条件耗能低、温和；制备参数可控性强、重现性好；制备出的油佐剂乳液粒径均一、可控，利于大规模工业化生产。
[0036]本发明的有益效果体现在:针对兽用疫苗油佐剂乳液制剂，提供一种乳滴尺寸均一、可控的乳液制备方法，所制备的乳液制剂乳滴粒径分布窄，储存稳定性显著提升，同时，可大大降低注射后在注射部位抗原的突释效应，持续释放可达I个月之久，体内免疫结果表明，均一油佐剂制剂可有效提升抗原特异性免疫应答水平和持续性。
【附图说明】
[0037]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0038]图1是本发明中快速膜乳化法制备乳液的装置和原理示意图。
[0039]图2是实施例1中传统高速搅拌法制备的乳液显微镜照片。
[0040]图3是实施例2中快速膜乳化法制备的乳液显微镜照片。
[0041]图4是实施例1和实施例2所述的乳液粒径分布图。
[0042]图5是实施例4中以BSA为模型抗原高速搅拌下制备的乳液的显微镜照片。
[0043]图6是实施例5中以BSA为模型抗原快速膜乳化制备的乳液的显微镜照片。
[0044]图7是实施例6所述的抗原体外释放行为结果图。
[0045]图8是实施例7中抗原在注射部位的募集情况。
[0046]图9是实施例8中不同乳液免疫后的新城疫的血凝抑制结果。
[0047]图10是实施例9中不同乳液免疫后的禽流感的血凝抑制结果。
[0048]图11是实施例10中不同乳液免疫后的新城疫的特异性抗体结果。
[0049]图12是实施例11中不同乳液免疫后的禽流感的特异性抗体结果。
[0050]图13是实施例12中的免疫后外周血中⑶4⑶87⑶4+⑶8的结果。
[0051]图14是实施例12中不同乳液免疫后的外周血中⑶4+⑶8+比例。
【具体实施方式】
[0052]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
[0053]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0054]实施例1
[0055]量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将油相加入至匀浆机中，在3500转/分钟条件下，将水相(W)加入至油相(O)中，均质匀浆3分钟，随后，将转数调整至10000转/分钟，继续乳化5分钟，得到W/Ο型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。光学显微镜照片如图2所示，结果表明所制备的乳液中有较大的液滴；所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定，采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定，用移液管取I滴上述制备的乳液加入至ImL的油相中，将其转移至ZetaPlus的样品池中，采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定，结果如图4所示，结果表明，传统高速搅拌制备的乳液平均粒径为2.226μπι，粒径分布系数PDI为0.187，粒径分布较宽。所制备乳液在常温下储存7个月后分层，在低温下储存12个月后分层，在高温(40°C下)储存3个月后分层。
[0056]实施例2
[0057]采用孔径为2.8 μ m的微孔膜制备含鸡新城疫-禽流感二联疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(0)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/Ο预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/Ο型油佐剂疫苗制剂。光学显微镜照片如图3所示，结果表明所制备的乳液粒径均一性好；所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定，采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定,用移液管取I滴上述制备的乳液加入至ImL的油相中，将其转移至ZetaPlus的样品池中，采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定。结果如图4所示，结果表明，快速膜乳化制备的乳液平均粒径为2.446 μ m，粒径分布系数PDI为0.057，与实施例1中高速搅拌制备的乳液相比，粒径均一性更佳。所制备乳液在常温下储存12个月不分层，在低温下储存18个月后不分层，在高温(40°C下)储存6个月后不分层。
[0058]实施例3
[0059]由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化，很难进行抗原量的准确定量，导致无法进行抗原体外释放行为研究。为此，采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原，进行乳液制备，进行抗原体外释放行为研究。精确称取一定量的BSA，将其溶于一定体积的去离子水中，配制浓度为500mg/mL的BSA溶液，量取20mL的BSA溶液作为水相(W)，量取60mL含Span80的白油和稳定剂硬脂酸铝作为油相(O)，将油相加入至匀浆机中，在3500转/分钟条件下，将水相(W)加入至油相(O)中，均质匀浆3分钟，随后，将转数调整至10000转/分钟，继续乳化5分钟，得到W/Ο型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳，其平均粒径为2.312 μ m，粒径分布系数PDI为0.198，光学显微镜照片如图5所示，结果表明所制备的乳液中有较大的液滴，粒径分布比较宽。
[0060]实施例4
[0061]由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化，很难进行抗原量的准确定量，导致无法进行抗原体外释放行为研究。为此，采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原，进行乳液制备，进行抗原体外释放行为研究。同样采用孔径为2.8 μ m的微孔膜进行乳液制备。精确称取一定量的BSA，将其溶于一定体积的去离子水中，配制浓度为500mg/mL的BSA溶液，量取20mL的BSA溶液作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(0)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/Ο预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳，其平均粒径为2.458 μ m,粒径分布系数PDI为0.060，光学显微镜照片如图6所示，结果表明所制备的乳液粒径分布窄，粒径均一性好。
[0062]实施例5
[0063]分别精确量取实施例3和实施例4中所制备的含模型抗原BSA的乳液lmL，将其加入至透析袋中，两端封好，将其置于140mL含0.0lM磷酸盐的等渗缓冲液(pH7.2)中，在37°C的恒温摇床中进行抗原释放，在预先设定的时间点，从透析袋外的缓冲液中取样400 μ L，同时，补加新鲜的磷酸盐缓冲液确保总体积不变，取样至第20天；采用微量BCA法测定样品中BSA蛋白含量，进而计算各时间点的蛋白累积释放量，并以时间作图，得到不同方法乳液中蛋白的释放行为曲线。结果如图7所示，