一种制备利那洛肽的方法
【专利摘要】本发明属于生物化学多肽合成技术领域，具体涉及一种利那洛肽的制备方法。主要解决现有合成步骤繁琐，原料成本高，合成周期长，收率低、杂质多，不适合工业化生产等技术问题。技术方案：一种制备利那洛肽的方法，包括以下步骤：（1）Fmoc?Tyr(tBu)?OH与载体树脂反应，得到Fmoc?Tyr(tBu)?树脂；（2）Fmoc?Tyr(tBu)?树脂与其他带有Fmoc保护基团的氨基酸逐一用活化剂偶联，得到利那洛肽线性肽树脂；（3）利那洛肽树脂经脱保护、裂解剂裂解、得到利那洛肽线性肽；（4）利那洛肽线性肽中的三个二硫键经氨水/DMSO体系环化后，得到利那洛肽粗肽；（5）利那洛肽粗肽在碱性缓冲溶液中纯化后，冻干即得到利那洛肽纯品。
【专利说明】
一种制备利那洛肽的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学多肽合成技术领域，具体涉及一种利那洛肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 利那洛肽由美国Ironwood公司研发，于2012年12月17日首次获批在美国上市的用 于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症（IBS-C)的多肽类药物，商品名为 LINZESS'本品是鸟苷酸环化酶-C(GCC)激动剂，作用机制可能为利那洛肽与小肠上皮细胞 内的GC-C受体结合，其激活GC-C，导致肠液分泌增加，并加速转运，而且还降低小肠内痛觉 神经的敏感性。
[0003] 利那洛肽是由14个氨基酸组成的，并且含有3对二硫键的多肽，具体结构序列如 下：
近年来，虽然对于利那洛肽的合成报道较多，但由于其结构复杂，尤其是二硫键的形成 过程中具有多个反应位点，选择性差。造成了副反应多、收率低、提纯困难等难题，而现有的 报道也是仅仅局限于实验室小量制备阶段。
[0004] Miriam 等人在文章 （Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Peptide Linaclotide，Biopolymers(2011),96(1) ,69-80)中报道三种合 成利那洛肽的方法：（1)采用Trt为Cys的保护基，固相合成利那洛肽线性粗肽，然后再在溶 液中随机氧化成利那洛肽;（2)采用Trt、Acm为Cys的保护基，用半选择性氧化的方法合成利 那洛肽；（3)采用Mmt、Acm、Trt或Acm、Trt、pMe0Bz或StBu、Trt、pMeOBz两两正交保护Cys，用 完全选择性的氧化方法合成利那洛肽。第一种方法，虽然步骤简单易行，但收率和纯度都很 低，不适用工业化生产;第二种方法，采用了半选择性氧化的策略，虽然降低了反应过程中 异构体的生成，但步骤相对繁琐，收率也没有较大提高，同样不适合工业化生产;第三种方 法，采用了完全选择性的氧化策略，虽然异构体生成进一步降低，但需要使用到多种氨基酸 侧链脱除试剂和不同的氧化试剂，步骤更加繁琐，杂质也相应增多，也不适合工艺放大。
[0005] 专利 CN102875655、CN1046231051、CN104628826、CN104844693 介绍 了利用固相合 成的方法逐一偶联氨基酸序列，然后利用不同氧化体系随机氧化的方法制得利那洛肽。虽 然这些方法最后都制得了目标物，但最多也就只得到了几十克级的样品，远远达不到工业 生产要求，同时，这些随机氧化过程也无法避免二硫键的错配，杂质多，收率低。专利 CN104163853虽然使用了片段偶联的方法制备来制备利那洛肽线性肽，但同样也存在上述 缺点。
[0006] 专利CN103626849、CN104974229、CN105017387采用了固相合成逐一偶联氨基酸序 列，然后分步定向氧化的方法制备利那洛肽，这些方法无一例外都用了不同的保护基保护 Cys，然后用不同的氨基酸侧链脱除试剂脱保护，分步氧化的方法。这些方法合成步骤繁琐， 原料成本高，合成周期长，收率低、杂质多，同样也不适合工业化生产。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种利用自动多肽合成仪快速、简捷的大量制备利那洛肽的方 法，主要解决现有合成方法存在的合成步骤繁琐，原料成本高，合成周期长，收率低、杂质 多，不适合工业化生产等技术问题。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种制备利那洛肽的方法，包括以下 步骤： (1 )Fmoc_Tyr (tBu) -OH 与载体树脂反应，得到 Fmoc-Tyr (tBu)-树脂； (2) Fmoc-Tyr(tBu)_树脂与其他带有Fmoc保护基团的氨基酸逐一用活化剂偶联，得到 利那洛肽线性肽树脂； (3) 利那洛肽树脂经脱保护、裂解试剂裂解、得到利那洛肽线性肽； (4) 利那洛肽线性肽中的三个二硫键经氨水/DMS0体系环化后，得到利那洛肽粗肽； (5) 利那洛肽粗肽在碱性缓冲溶液中纯化后，冻干即得到利那洛肽纯品。
[0009] 本发明所述的利那洛肽的制备方法中，步骤1中的载体树脂为HMP-AM树脂或Wang 树脂，优选为HMP-AM树脂，替代度为0.2~0.6mmol/g。
[0010] 本发明所述的利那洛肽的制备方法中，所采用的带有保护基团的氨基酸分别为： Fmoc- Tyr (tBu)-〇H、Fmoc_ Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc- Thr (tBu)-〇H、Fmoc_ Ala-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc- Asn (Trt)-OH和Fmoc- Glu (0tBu)-OH〇
[0011] 本发明所述的利那洛肽的制备方法中，步骤2中偶联所用的活化试剂为：HOBt/ DIC、HOBt/DCC、HBTU/HOBt或TBTU/HOBt混合试剂中的一种。进一步优选为:H0Bt/D IC。
[0012]本发明所述的利那洛肽的制备方法中，步骤3中所用的裂解试剂为三氟乙酸 (TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水组成的混合试剂。各组分的比例优选 为TFA:TIS:EDT :H20体积比=(90-96) :(1-4) :(1-4) :(1-4)，进一步的优选为TFA:TIS:EDT: 出0体积比=94:2:2:2。
[0013] 本发明所述的利那洛肽的制备方法中，步骤4中选用的氧化二硫键的体系为氨水/ DMS0体系，反应时间为5-24小时，进一步的优选为10-12小时。步骤(4)中所述的氨水/DMS0 体系，其中氨水质量百分浓度为0.5%-10%，DMS0质量百分浓度为1%-5%，进一步的优选为氨 水质量百分浓度1%_5%，DMS0质量百分浓度为2%，氧化体系的pH值为8~11，进一步优选为pH 值为9~11。溶剂优选为30%质量百分浓度的乙腈水溶液。
[0014] 本发明所述的利那洛肽的制备方法中，步骤5选用的提纯方法为碱性缓冲液中，用 反相高效液相色谱提纯。就是用pH=9~10的0.1%质量百分浓度氨水和乙腈为流动相进行梯 度洗脱。
[0015] 本发明的有益效果是:本发明公开了一种利用自动多肽合成仪大量制备利那洛肽 的工艺方法，本发明的特点在于：1、在合成多肽时，采用了稳定的HMP-AM树脂，同时序列中 所有的半胱氨酸均采用价格低廉的Fmoc-Cys(Trt)-〇H为原料，降低了成本。2、在氧化形成 三个二硫键过程中，采用氨水/DMS0体系，反应温和，有效地避免了二硫键的错配，收率高， 成功应用于大规模生产。3、最后纯化过程中采用碱性缓冲液为洗脱体系，得到了纯度较高 的利那洛肽。总收率为:15%~25%，纯度稳定在:95%以上。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明产品色谱图。
[0017] 图2为本发明产品质谱图。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例进一步地阐释本发明，但本发明并不仅限于这些实施例，任 何根据本发明做出的若干推演和替换，都应当视为本发明的权利保护范围。
[0019] 在本发明的【具体实施方式】中，所有保护氨基酸和树脂均购自希施生物科技(上海） 有限公司，其他常用试剂均有市售。
[0020] 本发明所用的英文缩写对应的中文含义，如下表：
实施例1:利那洛肽线性肽保护树脂的制备 (1)替代度为0.2~0.6 mmol/g HMP-AM树脂的制备 采用Fmoc保护法制得HMP-AM树脂445g(200 mmol)，用紫外吸光光度计测其替代度为： 0.45 mmol/g〇
[0021] (2)利那洛肽线性肽树脂的制备 利用自动多肽合成仪，首先将上步的Fm〇c-Tyr(tBu)-树脂在20%质量百分浓度的Pip/ DMF溶液中反应20 min，脱去保护基Fmoc，然后用DMF/DCM溶液自动洗2遍，为链接下一个氨 基酸做准备。
[0022] 利用多肽合成仪设定好的程序，按照多肽序列逐一偶联氨基酸。具体反应过程如 下：将Fmoc_AA-〇H(3 eq, 600 mmol)和H0Bt(3 eq, 600 mmol)溶于DMF(2.0 L)中，然后加 入DIC(3 eq，600 mmol)活化氨基酸。将Fmoc-AA-OH/HOBt/DIC混合溶液和上步的氨基酸树 脂转移到反应瓶中偶联，反应3-6小时(反应时间根据茚三酮检测法适当延长或缩短）后，排 除溶剂，固体树脂用DMF溶液洗三遍，然后用20%质量百分浓度Pip/DMF脱除保护基Fmoc。然 后不断重复以上步骤，链接下一个氨基酸，直至完成整个氨基酸序列，得到利那洛肽线性肽 树脂1088 g。
[0023]实施例2:利那洛肽线性肽的制备 氮气保护下，利那洛肽线性肽树脂在TFA/TIS/EDT/water体积比（94: 2:2:2)溶液中裂 解。具体操作如下:将上步的利那洛肽树脂与TFA/TIS/EDT/water溶液混合(5-10 mL/g)，反 应4小时后，过滤除去裂解下来的树脂，然后用TFA溶液洗2遍。合并滤液，用旋转蒸发仪蒸去 滤液，然后加入冷的乙醚(5-10 mL/g)，固体析出，过滤并用冷乙醚洗3遍，得到利那洛肽线 性肽，白色固体251.97 g，纯度:62%，收率:50.9%。
[0024]实施例3:利那洛肽粗肽的制备 将利那洛肽线性肽(60.0 g)溶于1%质量百分浓度的氨水和30%质量百分浓度乙腈的混 合水溶液（25 L)中，然后加入2%质量百分浓度的DMS0溶液，反应过程中用氨水调节pH 9-10,室温搅拌24小时，LC-MS监测反应进程。重复以上实验进程，将所有的利那洛肽线性肽氧 化成利那洛肽。得到利那洛肽252 .0 g，纯度:50.1%，收率:41.1%。
[0025] 注:LC-MS的监测和分析条件如下 色谱条件:Agilent 1290;C18 色谱柱（1·7μηι，150x3mm);检测波长:λ=214ηηι 流动相A: 0.1%质量百分浓度的TFA水溶液； 流动相B: 0.1%质量百分浓度的TFA色谱乙腈溶液； 梯度洗脱:流动相A:流动相B质量百分浓度=0-60%，流速:0.4 mL/min，柱温:60 °C。 [0026]实施例4:利那洛肽精肽的制备 利那洛肽粗肽经碱性缓冲液纯化，转盐，冻干得到利那洛肽精肽。纯化条件如下:C-18 色谱柱，检测波长:214 nm。流动相A: 0.1%质量百分浓度氨水(pH 9-10)，流动相B: ACN，梯度 洗脱:首先以5%质量百分浓度的流动相B洗脱30 min，然后在60 min内逐步增加到10~35 % 质量百分浓度的流动相B，流速为25 mL/min。收集目标峰组分，冷冻干燥，得到的多肽固体 再溶解于水和乙腈的溶液中，再次冻干除去残留的氨水，得到的多肽纯品溶于0.5 %质量百 分浓度乙酸的水和乙腈(体积比=80/20)的混合溶液中转盐，再次冻干得到利那洛肽纯品， HPLC 纯度：96.5%，总收率：20.9%。见图 1、2。
[0027] 实施例5:利那洛肽线性肽保护树脂的制备 (1)替代度为0.49 mmol/g HMP-AM树脂的制备 采用Fmoc保护法制得HMP-AM树脂2500 g(l .225 mol)，用紫外吸光光度计测其替代度 为：0.49 mmol/g〇
[0028] (2)利那洛肽线性肽树脂的制备 利用自动多肽合成仪，首先将上步的Fm〇c-Tyr(tBu)-树脂在20%质量百分浓度的Pip/ DMF溶液中反应20 min，脱去保护基Fmoc，然后用DMF/DCM溶液自动洗2遍，为链接下一个氨 基酸做准备。
[0029] 利用多肽合成仪设定好的程序，按照多肽序列逐一偶联氨基酸。具体反应过程如 下：将Fmoc-AA_0H(3 eq, 3.675 mol)和H0Bt(3 eq, 3.675 mol)溶于DMF(20 L)中，然后加 入DIC(3 eq，3.675 mol)活化氨基酸。将Fmoc-AA-OH/H0Bt/DIC混合溶液和上步的氨基酸 树脂转移到反应瓶中偶联，反应3-6小时(反应时间根据茚三酮检测法适当延长或缩短)后， 排除溶剂，固体树脂用DMF溶液洗三遍，然后用20%质量百分浓度Pip/DMF脱除保护基Fmoc。 然后不断重复以上步骤，链接下一个氨基酸，直至完成整个氨基酸序列，得到利那洛肽线性 肽树脂6.06 kg。
[0030] 实施例6:利那洛肽线性肽的制备 氮气保护下，利那洛肽线性肽树脂在TFA/TIS/EDT/water体积比（94: 2:2:2)溶液中裂 解。具体操作如下:将上步的利那洛肽树脂与TFA/TIS/EDT/water溶液混合(5-10 mL/g)，反 应4小时后，过滤除去裂解下来的树脂，然后用TFA溶液洗2遍。合并滤液，用旋转蒸发仪蒸去 滤液，然后加入冷的乙醚(5-10 mL/g)，固体析出，过滤并用冷乙醚洗3遍，得到利那洛肽线 性肽，白色固体3.56 kg，纯度:46.2%，收率:38.9%。
[0031] 实施例7:利那洛肽粗肽的制备 将利那洛肽线性肽(60 g)溶于1%质量百分浓度的氨水和30%质量百分浓度乙腈的混合 水溶液（100 L)中，然后加入2%质量百分浓度的DMS0溶液，反应过程中用氨水调节pH 9-10， 室温搅拌24小时，LC-MS监测反应进程。重复以上实验进程，将所有的利那洛肽线性肽氧化 成利那洛肽。得到利那洛肽1.58 kg，纯度:59.9%，收率:50.4%。
[0032] 注:LC-MS的监测和分析条件如下 色谱条件:Agilent 1290;C18 色谱柱（1·7μηι，150x3mm);检测波长:λ=214ηηι 流动相A: 0.1%质量百分浓度的TFA水溶液； 流动相B: 0.1%质量百分浓度的TFA色谱乙腈溶液； 梯度洗脱:流动相A:流动相B质量百分浓度=0-60%，流速:0.4 mL/min，柱温:60 °C。 [0033]实施例8:利那洛肽精肽的制备 利那洛肽粗肽经碱性缓冲液纯化，转盐，冻干得到利那洛肽精肽。纯化条件如下:C-18 色谱柱，检测波长:214 nm。流动相A: 0.1%质量百分浓度氨水(pH 9-10)，流动相B: ACN，梯度 洗脱:首先以5%质量百分浓度的流动相B洗脱30 min，然后在60 min内逐步增加到10~35 % 质量百分浓度的流动相B，流速为25 mL/min。收集目标峰组分，冷冻干燥，得到的多肽固体 再溶解于水和乙腈的溶液中，再次冻干除去残留的氨水，得到的多肽纯品溶于0.5 %质量百 分浓度乙酸的水和乙腈(体积比=80/20)的混合溶液中转盐，再次冻干得到利那洛肽纯品， HPLC 纯度:98 · 44%，总收率：19 · 6%。见图 1、2。
【主权项】
1. 一种制备利那洛肽的方法，其特征是包括以下步骤： (1 )Fmoc_Tyr (tBu) -OH 与载体树脂反应，得到 Fmoc-Tyr (tBu)-树脂； (2) Fmoc-Tyr(tBu)_树脂与其他带有Fmoc保护基团的氨基酸逐一用活化剂偶联，得到 利那洛肽线性肽树脂； (3) 利那洛肽树脂经脱保护、裂解剂裂解、得到利那洛肽线性肽； (4) 利那洛肽线性肽中的三个二硫键经氨水/DMS0体系环化后，得到利那洛肽粗肽； (5) 利那洛肽粗肽在碱性缓冲溶液中纯化后，冻干即得到利那洛肽纯品。2. 根据权利要求1所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤（1)中载体树脂为 Wang树脂或HMP-AM树脂，替代度为0.2~0· 6mmo Ι/g。3. 根据权利要求2所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤（1)中载体树脂为 HMP-AM 树脂。4. 根据权利要求1所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤(2)中带有Fmoc保 护基团的氨基酸分别为:Fmoc- Tyr (tBu)-〇H、Fmoc_ Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Thr (tBu)-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc- Asn (Trt)-OH和Fmoc- Glu (OtBu)-OH， 其中6个Cys的侧链全部采用Trt保护。5. 根据权利要求1所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤(2)中活化试剂为： HOBt/D IC、HOBt/DCC、HBTU/HOBt或TBTU/HOBt混合试剂中的一种。6. 根据权利要求5所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是：活化剂为:HOBt/DIC混 合试剂。7. 根据权利要求1所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤(3)中所用的裂解 试剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2_乙二硫醇和水组成的混合试剂，各组分的体积比为 TFA:TIS:EDT: H20=90-96:1-4:1-4:1-4。8. 根据权利要求7所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:混合试剂各组分的体积 比为 TFA:TIS:EDT:H20=94:2:2:2。9. 根据权利要求1所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤(4)中所述的氨水/ DMS0体系，其中氨水质量百分浓度为0.5%-10%，DMS0质量百分浓度为1%-5%，氨水/DMS0体系 的pH值为8~11，溶剂为30%质量百分浓度的乙腈水溶液。10. 根据权利要求9所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是：所述的氨水/DMS0体 系，其中氨水质量百分浓度为1%_5%，DMS0质量百分浓度为2%，氨水/DMS0体系的pH值为9~ 11〇11. 根据权利要求1所述的一种制备利那洛肽的方法，其特征是:步骤(5)中所述的纯化 方法为碱性缓冲溶液为洗脱相的反相高效液相柱色谱纯化，就是用pH=9~10的0.1%质量百 分浓度氨水和乙腈为流动相进行梯度洗脱。
【文档编号】C07K1/06GK106008674SQ201610644791
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】张恒维, 王为, 施学庚, 杨培, 朱国基, 张倩, 巢庆, 乔立超, 田晓博
【申请人】希施生物科技（上海）有限公司