Atp作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法
【专利摘要】本发明涉及生物领域，特别涉及ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法。本发明不需用到任何同位素标记的材料因此克服了现有技术不利于安全操作的缺陷；分离的细胞不需要长时间培养来检测克服了现有技术检测周期长的缺点；细胞只需裂解就可快速检测，克服了现有技术操作繁琐的不足，且受实验条件影响小。本发明还提供了非疾病诊断目的免疫能力的评价方法，操作方便快捷安全，敏感性好，精确度高，可检测范围宽，结果可较准确获得机体的免疫状态。
【专利说明】
ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物领域，特别设及ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及 评价方法。
【背景技术】
[0002] 机体担负免疫功能的物质基础是免疫系统（immune system)。免疫系统由免疫组 织与器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统可分为天然免疫系统（即非特异性免疫系 统）和获得性免疫系统（即特异性免疫系统）。获得性免疫系统一般可W分成两大类：体 液免疫和细胞免疫。体液免疫主要设及人体内可W与各种外源抗原结合的抗体，它们是一 类大分子蛋白质，也称作免疫球蛋白，包括IgG、IgA、IgM和I曲、I姐五种类型。细胞介导 的免疫反应（cell-mediated immunity, CMI)主要设及两大类细胞：B细胞和T细胞，T细胞 还可W分成CD4细胞和CD8细胞等；从功能上简单地说，B细胞可W产生各种抗体，而T细 胞本身就能杀死或吞隧进入体内的各种病原体。
[0003] "免疫力下降"指的就是体内抗体水平降低或者T、B细胞功能降低，使得人体容易 发生各种感染。劳累、营养不良、慢性疾病（例如结核病、肝炎、恶性肿瘤、糖尿病）、艾滋病、 药物（如化疗药或免疫抑制剂）等都会引起机体免疫力下降。在临床上，检测免疫力的主 要指标是血清免疫球蛋白（Ig)定量和T细胞亚群分析。如果Ig量降低或者B细胞、T细 胞数目降低或功能异常（特别是CD4、CD8细胞）都提示可能存在免疫力下降。
[0004] 免疫力低下的身体易于被感染或患癌症；免疫力超常也会产生对身体有害的结 果，如引发过敏反应、自身免疫疾病等。因此，准确检测机体免疫力高低具有重要的现实意 义。
[0005] 目前检测机体免疫能力的技术主要有：1.淋己细胞增殖检测技术：淋己细胞前体 没有任何效应功能，但在遇到抗原刺激时可W增殖，淋己细胞增殖是评估机体免疫能力的 一种重要方法。目前临床上常用的检测淋己细胞增殖的方法有3H-TdR渗入法，Μ?Τ法W及 流式细胞仪检测法。2. T细胞分泌功能测定技术：体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺 激后，分泌各种细胞因子，通过检测各细胞因子含量，生物学活性或基因表达水平，W反映 T 细胞功能。常用的检测方法有Elisa，Elispot，PCR/RT-PCR。3. T细胞介导的细胞毒活性测 定技术：细胞毒性T淋己细胞（CTLs)是T细胞在体内或体外经抗原刺激后产生的一种效应 细胞，可特异性裂解祀细胞，运种能力可W反映机体的抗肿瘤能力，因此细胞毒活性检测可 W反映机体的免疫能力。常用的方法有铭释放检测和LDH释放检测。
[0006] 但是免疫力检测方法具有如下问题：1.淋己细胞增殖检测技术的缺陷：3H-TdR渗 入法它表示的是某一定量培养液中细胞的DNA合成总量，而不是特异性T细胞的试剂数目， 受体外培养条件影响而且还存在放射性核素污染污染问题；Μ?Τ方法受实验条件影响很 大，培养体系需要严格控制；流式细胞技术分析需要一定的设备条件及所需实验时间周期 较长。2. T细胞分泌功能测定技术的缺陷：Elisa方法和Elispot方法操作较繁琐检测所需 时间较长，检测的T细胞必须能分泌目标细胞因子；PCR/RT-PCR存在假阳性和假阴性的结 果，不一定得到的就是目的片段，操作严格否则易污染，最重要的是常规的PCR检测不出潜 伏性的目的片段。3. T细胞介导的细胞毒活性测定技术的缺陷：铭有放射性，不利于安全操 作和废物处置W及不是定量分析且操作步骤多；LDH是细胞本身代谢的产物，可能存在自 发释放现象，且效应细胞作用于祀细胞后也会有损伤，同样会释放LDH，从而影响细胞毒活 性测定的精确性。
[0007] 目前市场上所有相关的产品及检测手段均不能对患者的治疗效果进行有效的分 析与评估，并且对于HIV病人或免疫能力低下者均不能适用。因此，提供一种免疫力强弱的 检测指标具有现实意义。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方 法。W ATP评价免疫能力敏感性好，精确度高，可检测范围宽，结果可较准确获得机体的免 疫状态。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0010] 本发明提供了 ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途。
[0011] Ξ憐酸腺巧（AT巧在生物体的生命活动中发挥着重要作用：血清免疫球蛋白的合 成W及分泌乃至发挥功能的过程都需要ATP的参与；另一方面T细胞发挥功能来杀死或吞 隧进入体内的各种病原体也需要ATP提供能量；Ca2+，DAG等第二信使对于免疫信号通路的 传导W及放大起着必不可少的作用，但它们的合成分泌W及跨膜运输都需要ATP ;此外ATP 产生后会分泌到胞外，与其受体结合，进而激活第二信使，进行信号转导。因此，细胞的Ξ憐 酸腺巧（AT巧值的测定对于检测机体免疫能力具有重要的临床意义，对免疫能力做出客观 的评估。进而能够提早预防感染，及早进行干预治疗免疫性疾病，又能检测治疗恢复的效 果。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述评价的标准为：ATP的浓度< 150ng/ml或 ATP的浓度> 500ng/ml为免疫能力异常。
[0013] 在本发明的另一些具体实施方案中，所述ATP的浓度< 150ng/ml为免疫力低下。
[0014] 在本发明的另一些具体实施方案中，所述ATP的浓度> 500ng/ml为免疫力超常。
[0015] 在本发明的另一些具体实施方案中，150ng/ml《ATP的浓度< 5(K)ng/ml为免疫力 正常。
[0016] 本发明还提供了一种非疾病诊断目的免疫能力的评价方法，包括如下步骤：
[0017] 步骤1 :获得试样中的ATP ;
[0018] 步骤2 :测定所述ATP的浓度；
[0019] 步骤3 :根据所述ATP的浓度，获得免疫能力的强弱。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述评价方法的标准为ATP的浓度< 150ng/ml 或ATP的浓度> 500ng/ml为免疫能力异常。
[0021] 具体到本发明的另一些具体实施方案，所述评价方法中ATP的浓度< 15化g/ml为 免疫力低下。
[0022] 具体到本发明的另一些具体实施方案，所述评价方法中所述ATP的浓度> 5(K)ng/ ml为免疫力超常。
[0023] 具体到本发明的另一些具体实施方案，所述评价方法中150ng/ml《ATP的浓度 < 500ng/ml为免疫力正常。
[0024] 巧光法是最常用的测定ATP的实验方法，原理是根据蛋火虫巧光素酶（firefly luciferase)氧化巧光素产生巧光时需要ATP提供能量研制而成。当蛋火虫巧光素酶和巧 光素都过量时，在一定的浓度范围内巧光的产生和ATP的浓度成正比。运样就可W高灵敏 地检测溶液中的ATP浓度。具体原理如下： 阳0巧]
[00%] 本发明提供了 ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途。本发明不需用到 任何同位素标记的材料因此克服了现有技术不利于安全操作的缺陷；分离的细胞不需要长 时间培养来检测克服了现有技术检测周期长的缺点；细胞只需裂解就可快速检测，克服了 现有技术操作繁琐的不足，且受实验条件影响小。本发明还提供了非疾病诊断目的免疫能 力的评价方法，操作方便快捷安全，敏感性好，精确度高，可检测范围宽，结果可较准确获得 机体的免疫状态。本方法可W检测特定细胞的ATP浓度，避免了现有技术可能造成的假阳 或假阴性，提高了测定的精确度；本方法通过对细胞整体水平的免疫状态进行分析，适用于 HIV病人或免疫能力低下者。
【附图说明】
[0027]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[00測图1示实施例1中样本统计图；其中横坐标Η示正常人，D示免疫力低下者；纵坐 标示ΑΤΡ的浓度，单位为ng/mL ;
[0029] 图2示实施例1中样本统计图；其中圆圈示每个样本的对应值；横坐标Η示正常 人，D示免疫力低下者；纵坐标示ΑΤΡ的浓度，单位为ng/mL ;
[0030] 图3示实施例1中待测溶液中ATP的可检测的范围和灵敏度；其中，纵坐标为相对 巧光单位；横坐标为ATP的浓度，单位为μΜ ;可见，检测范围为0.0 l-lOuM，精确度高，可检 测范围广；
[0031] 图4示实施例2检测样本的检测结果；
[0032] 图5示实施例3检测样本的检测结果；
[0033] 图6示对比例的检测结果。
【具体实施方式】
[0034] 本发明公开了 ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法，本领域 技术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范 围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0035] 本发明提供的ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途及评价方法中 所用试剂均可由市场购得。其中，ATP标准品（广州斯佳），ATP检测液（sigma公 司），RPMI1640 (gibco 公司），Ficoll (sigma 公司），PHA (sigma 公司），TRIS (sigma)， EDTA(sigma)。
[0036] 下面结合实施例，进一步阐述本发明： 阳〇37] 实施例1 阳0測实验组：
[0039] 第一部分：(-)分离获得细胞（Ficoll法分离）
[0040] 1.取一支15ml锥底管，加入6-9ml PBS或RPMI1640,加入3-6ml血样，混匀。
[0041] 2.另取一支新的15ml锥底管，加入3-6ml Ficoll分离液，在小屯、将稀释的血样加 到Ficoll上层，使分层清晰。
[0042] 3.《1000。(：，25。(：，离屯、20至40111地6阿1?5调成0。
[0043] 4.将上层血浆转移至一支新的1. 8ml冻存管中，-80°C保存；吸出血浆至白色分层 (即单核细胞层）上约0. 5-lcm处即可。
[0044] 5.小屯、转移PBMCs 至一支新的 1. 5ml 离屯、管；《1000邑，20°(：-25°(：，离屯、4-10111111。 加入PBS至总体积为1ml重悬细胞。
[0045] 6.更换PBS重复此步骤洗涂3次。台吩蓝染色l-5min数细胞数量和存活率。
[0046] 仁)磁珠法分离细胞（W CD4磁珠为例）
[0047] 1.邸TA或ACD采血管采集静脉血。
[0048] 2.取 125ul 全血，用 350U1PBS 稀释，加入 25ulCD4beads。
[0049] 3.室溫混匀lOmin，置于磁板上吸附2min。 阳化0] 4.弃上清，用300U1PBS洗Ξ遍。
[0051] 第二部分刺激细胞检测ATP值 阳0巧 7.将获得的细胞均分为4份，细胞量为1-3X105每孔：分别设为空白对照（-)， 5-15ug/ml PHA，相关疾病特异性抗原（比如结核病用ESAT6/CFP-10 5-15ug/ml)刺激 16-2地，置于37度5% C02培养。
[0053] 8.过夜后将细胞《800g，20°C -25°C，离屯、5-lOmin，加入200ul裂解液充分裂解 细胞（可选择：4°C，离屯、12000g，5-lOmin取上清）。
[0054] 9.立即置于冰上待测。 阳化日]10.标准品配制：冰上溶解待用试剂，把ATP标准溶液用ATP裂解液稀释成适当的 浓度梯度。具体的浓度需根据样品中ATP的浓度而调节。
[0056] 11.加 lOOulATP检测液到96孔。室溫放置3-5分钟，W使本底性的ATP全部被消 耗掉，从而降低本底。
[0057] 12.加上lO-lOOul样品或标准品，迅速用枪（微量移液器）混匀，至少间隔2秒 后，立即用酶标仪562皿测定。检测前等待时间为2秒，检测时间为10秒。
[0058] 13.根据ATP含量进行分析。
[0059] 第Ξ部分分析免疫能力
[0060] 样本来源：广州市胸科医院。其中，样本1-2已经确定为免疫力超常，样本3-59确 定为免疫力正常，样本60-71确定为免疫力低下。ATP浓度检测结果见表1。
[0061]
W64] 上述样本的数据统计图见图1、图2,其中，Η:正常人，D :已确定为免疫力低下者。 阳0化]由表1可知，ATP的浓度< 150ng/ml或ATP的浓度> 500ng/ml为免疫能力异常； 其中，ATP的浓度< 15化g/ml为免疫力低下；ATP的浓度> 5(K)ng/ml为免疫力超常；150ng/ ml《ATP的浓度< 500ng/ml为免疫力正常。
[0066] 综合上述分析可知，通过检测ATP的浓度可W获得免疫能力的强弱。 W67] ATP 检测：
[0068] 1.在冰上进行标准品配制：冰上溶解ATP标准品胆存液（lOumol/L)，把ATP标准 溶液用 ATP 裂解液稀释成 0, 0. 01，0. 025, 0. 05, 0. 075, 0. 1，0. 25, 0. 5, 1. 0, 10.0 umol/L 浓度 梯度。ATP标准溶液浓度可根据样品中ATP的浓度而调节。 W例 2.在冰上加入lOul样品或标准品于96孔白色不透明酶标板中，置于酶标仪中选 择LU，终点法，562皿检测其本底的巧光值。
[0070] 3.加 lOOulATP检测液到含样品或标准品的96孔白色不透明酶标板中，迅速用排 枪混匀，立即用酶标仪选择LU，终点法，562皿测定（要事先设置好）。
[0071] 4.根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。
[0072] 检测结果见图3。由图3可知，可检测范围为O.Ol-lOuM，而常规的细胞或组织裂 解液中ATP的浓度仅为0. 1-1 μ mol/L。因此，本发明的检验精确度高，灵敏度好，可检测范 围广。 阳〇7引实施例2
[0074] 取1位正常人及7位TB患者全血6ml，Ficoll法分离PBMC，用200ul Lysis裂解 细胞，检测样本的ATP浓度（纵坐标），获得免疫能力。 阳0巧]方法：
[0076] 1.分离 PBMC
[0077] ①用肝素抗凝管采集血液（室溫放置不超过8小时），分离前上下颠倒混匀8次， 使细胞分布均匀。 阳07引②取一支15ml离屯、管，加入5ml RPMI1640(无 FB巧，用己氏吸管加入等体积 (RPMI1640 :血液为1:1)的血样，轻轻地上下颠倒混匀8次，达到颜色均一。 阳079] ③另取一支新的15ml离屯、管，用电动移液枪加入5ml Ficoll分离液（分离液与 血样体积比为1:2)，将离屯、管倾斜一定角度，用己氏吸管小屯、将稀释的血样加到Ficoll上 层，使分层清晰。
[0080] ④将离屯、机条件设置为800g，20°C，acce，化ake均设为0,离屯、30min。
[0081] ⑥离屯、后用己氏吸管弃掉血浆至白色分层（即单个核细胞层）上约0.5-lcm处即 可，切勿揽动白膜层。
[0082] ⑧再用己氏吸管小屯、转移白膜层至一支新的1. 5ml离屯、管（吸出体积为1. 5ml);
[0083] ⑦将离屯、机条件设置为5000rpm，20°C，离屯、lOmin，离屯、后倒净离屯、管中液体并 置于灭菌的吸水纸上，只留附在壁上的细胞，加入RPMI (无 FB巧至总体积为1. 5ml，轻轻吹 打重悬细胞。
[0084] ⑨将离屯、机条件设置为3000rpm，20°C，离屯、lOmin，离屯、后倒净离屯、管中液体并 置于灭菌的吸水纸上，只留附在壁上的细胞，然后加入1. 5ml RPMI (无 FB巧，轻轻吹打重悬 细胞。 阳0化]⑨第Ξ次将离屯、机条件设置为400g，20°C，离屯、lOmin，离屯、后倒净离屯、管中液体 并置于吸水纸上，只留附在壁上的细胞，加入1ml RPMI (无 FB巧培养基轻轻吹打重悬细胞。 取lOul用于台吩蓝染色，计数并计算存活率（具体操作参考细胞计数）。
[0086] 2. ATP 检测
[0087] 1.取按上述方法分离计数的PBMC细胞每孔30万个，加入到1. 5ml离屯、管中， 800g，20°C，离屯、7min，离屯、后倒净离屯、管中液体后置于吸水纸上吸一下，加入200ul裂解 液灯'13斗0了4:20臟〇1/1化13巧臟〇1/1^0了4,9^.75)在冰上充分裂解细胞5111111，然后置 于100度水浴锅中煮沸Imin，立即置于冰上待测。
[0088] 2.在冰上进行标准品配制：冰上溶解ATP标准品胆存液（lOumol/L)，把ATP标准 溶液用ATP裂解液稀释成0, 0. 01，0. 05, 0. 1，0. 5, 1. 0, 5. 0, 10.0 umol/L浓度梯度。ATP标准 溶液浓度可根据样品中ATP的浓度而调节。
[0089] 3.在冰上加入lOul样品或标准品于96孔白色不透明酶标板中，置于酶标仪中选 择LU，终点法，562nm检测其本底的巧光值。
[0090] 4.加 lOOulATP检测液到含样品或标准品的96孔白色不透明酶标板中，迅速用排 枪混匀，立即用酶标仪选择LU，终点法，562nm测定（要事先设置好）。
[00川根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。
[0092] 如图4所示：TB患者免疫功能低于正常人，病人4、5、6属于免疫力低下。
[0093] 可见，通过检测ATP的浓度来获得免疫能力的强弱具有可行性和准确性。
[0094] 实施例3 阳ο巧]取1位正常人及6位ΤΒ (肺结核）患者全血6ml，Ficoll法分离PBMC，用200ul Lysis裂解细胞，检测样本的ATP浓度（纵坐标），获得免疫能力。方法同实施例2。
[0096] 如图5所示：TB患者免疫功能低于正常人，病人1、5属于免疫力低下，病人4经过 抗结核治疗后出院，免疫功能恢复正常，属于免疫力正常。
[0097] 可见，通过检测ATP的浓度来获得免疫能力的强弱具有可行性和准确性。 阳〇9引对比例
[0099] 全血分离得到T细胞，用加 g/mlPHA刺激20h，检测细胞因子（如IFN- 丫，比-2等） 的水平，W反映 T细胞的功能。
[0100] 方法：取1位正常人（实施例1中正常人样本5)全血6ml，Ficoll法分离PBMC， 用加 g/mlPHA刺激20h后，1200g，lOmin离屯、细胞，小屯、贴壁吸取上清，ELISA检测。 阳 101] ELISA 步骤： 阳10引 a)包被海孔加入lOOul R1 (包被抗体）到酶标板底部。4°C，20化pm摇动过夜。
[0103] b)洗涂：每孔加200ul R2 (洗涂液），室溫静置Imin，倒掉拍干，洗涂3次。
[0104] C)封闭：每孔加入200ul R3 (封闭液），室溫，200巧m摇动封闭比。 阳1化]d)洗涂：每孔加200ul R2 (洗涂液），室溫静置Imin，倒掉拍干，洗涂3次。
[0106] e)干燥：其余未用完的酶标板条在通风楓内风干45min，然后密封，4°C保存一周 左右。 阳107] f)加样：样本、标准品用R3稀释巧0ul+50ul)。加入lOOul于酶标板中，室溫， 20化pm摇动解育化。
[0108] g)洗涂：每孔加200ul R2 (洗涂液），室溫静置Imin，倒掉拍干，洗涂5次。
[0109] h)二抗解育：每孔加入lOOul R4,室溫，200巧m摇动解育比。
[0110] i)洗涂：每孔加200ul R2 (洗涂液），室溫静置Imin，倒掉拍干，洗涂5次。 阳111] 如显色：加入lOOul底R5(底物显色液），避光显色15min。
[0112] k)酶标仪设定：ABS终点法检测450nm吸光值，630nm为参考波长。
[0113] 1)终止：50ul终止液R6 (1M硫酸），5min内测0D450波长，630皿为参考波长。
[0114] 标准曲线如图6所示：PHA刺激2化后，可检测到T细胞活化，但此方法实验周期 长，但此方法检测的IFN-γ含量低（皮克级别），检测范围窄，精确度降低，不能很好的反应 Τ细胞免疫能力，且实验周期长，操作复杂繁琐。 阳11引结果见表2。
[0116] 表2检测结果 阳117]
[0118] 由表1结果可知，ΡΗΑ刺激2化后，IFN-丫含量显著上升，说明Τ细胞活化。但 IFN-丫含量低（皮克级别），不能很好地体现免疫能力。
[0119] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可w做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. ATP作为生物标志物用于评价免疫能力的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述评价的标准为：ATP的浓度< 150ng/ m或ATP的浓度彡500ng/ml为免疫力异常。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述ATP的浓度< 150ng/ml为免疫 力低下。4. 根据权利要求1至3任一项所述的用途，其特征在于，所述ATP的浓度彡500ng/ml 为免疫力超常。5. 根据权利要求1至4任一项所述的用途，其特征在于，150ng/ml彡ATP的浓度 < 500ng/ml为免疫力正常。6. -种非疾病诊断目的免疫能力的评价方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :获得试样中的ATP ; 步骤2 :测定所述ATP的浓度； 步骤3 :根据所述ATP的浓度，获得免疫能力的强弱。7. 根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法的标准为ATP的浓度 < 150ng/ml或ATP的浓度彡500ng/ml为免疫能力异常。8. 根据权利要求6或7所述的评价方法，其特征在于，所述ATP的浓度< 150ng/ml为 免疫力低下。9. 根据权利要求6至8任一项所述的评价方法，其特征在于，所述ATP的浓度多500ng/ ml为免疫力超常。10. 根据权利要求6至10任一项所述的评价方法，其特征在于，150ng/ml彡ATP的浓 度< 500ng/ml为免疫力正常。
【文档编号】G01N33/68GK105823882SQ201510009707
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月8日
【发明人】楼建荣
【申请人】广州市雷德生物科技有限公司