拟南芥 (Ar油idopsisthaliana)co^0的花（参照农杆菌介导的拟南芥薩花侵染法参照Clou曲 与Bent(1998)方法（Clou曲SJ,BentAF. 1998.Floraldip:asimplifiedmethodfor Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ, 16:735~ 743)：
[006引首先将阳性重组菌GV3101/TaPPDKl:Pg巧gus活化，然后吸取1ml菌液加入40ml含有Kan巧Omg/l)和Rif巧Omg/l)的LB培养基中，28°C，230巧m摇床上培养至ODe。。达0. 8 左右。将菌液转移至50ml离屯、管内，3000rpm，离屯、5min，去上清液。配制侵染液（1/2MS培 养基含5%薦糖，500μl/lSilwetl-77。pH调为5.8)。向收集菌体的离屯、管中加入约30ml 侵染液，缓慢混匀，重悬菌液。将初花的拟南芥花序浸泡在侵染液内Imin左右。暗条件下 处理约1化后，置于拟南芥适宜环境内，一周后，重复侵染一次。
[0066] 得到TO代转TaPPDKl拟南芥，收获得到T1代转TaPPDKl拟南芥种子。将T1代转 TaPPDKl拟南芥种子播种经连续的潮霉素巧Omg'Li)抗性筛选，T3代不再分离的株系视为 纯合系，命名为T3代转TaPPDKl拟南芥。
[0067]WT3 代转TaPPDKl拟南芥根的cDNA为模板，用Q7XYB5-F1:GGCAGCAAGGAAAAATGG; PGFPGUS-N0S-R:CAAATGGACGAACGGATAAA进行巧光定量PCR。W拟南芥AtUBQ3 基因作为内 参AtUBQ3-F:5'-CGGAAAGACCATTACTCTGGA-3' ；AtUBQ3-R:5'-CAAGTGTGCGACCATCCTCAA-3'。W野生型拟南芥col-0为对照。
[0068] 结果如图4所示，TaPPDKl在野生型拟南芥（WT)中没有表达，TaPPDKl在 T3代转TaPPDKl拟南芥中都有表达，株系P-12-27-4表达量最低的设定为1，选择 TaPPDKl表达量比较高的T3代转TaPPDKl拟南芥株系P-12-13-17 (35s:TaPPDKl-1)， P-12-22-18 (35s:TaPPDKl-2)和P-12-23-30 (35s:TaPPDKl-3)进行后续耐盐性分析。
[0069]Real-timeRT-PCR采用AtUBQ3均一化表达量。误差线来自3个独立实验。
[0070]Ξ、转TaPPDKl拟南芥的耐盐性
[00川 1、种子萌发
[0072]T3 代转TaPPDKl拟南芥株系P-12-13-17 (35s:TaPPDKl-l)， P-12-22-18 (35s:TaPPDKl-2)和P-12-23-30 (35s:TaPPDKl-3)和野生型拟南芥（co^O)种 子点种在含有150Mm化Cl的MS平板中，W不含化Cl的MS培养基培养为对照，播种后，4°C 春化3d后置于溫室（22°C)正常培养。每个株系50个种子，实验重复3次，结果取平均值。
[0073] 当种子幼根已经穿出种皮被认为萌发，每天统计种子的萌发率，并依据下列公式 计算相对萌发率：
[0074]
[00巧]结果如图5所示，A为表型，B为相对萌发率统计结果，150Mm化C1胁迫条件下， 种子萌发第二天开始，T3代转TaPPDKl拟南芥株系（35s:TaPPDKl-l)、（35s:TaPPDKl-2) 和（35s:TaPPDKl-3)的相对萌发率显著高于野生型拟南芥种子，到萌发第屯天，Τ3代转 TaPPDKl拟南芥株系（35s:TaPPDKl-l)、（35s:TaPPDKl-2)和（35s:TaPPDKl-3)种子相对萌 发率都在80%W上，野生型拟南芥只有64. 7% ;
[0076] 因此过表达TaPPDKl基因可W提高了转基因植物种子萌发期的耐盐能力。
[0077] 2、根长实验
[0078]T3 代转TaPPDKl拟南芥株系 35s:TaPPDKl-l(linel)、35s:TaPPDKl-2(line2)和 35s:TaPPDKl-3(line3)和野生型拟南芥（co^O)种子种植在MS平板中萌发，萌发5d后，野 生型和转基因株系36个萌发的幼苗被小屯、的转移到新的含有150mM化C1的MS平板中，竖 直培养7d后，测量幼苗的根长，并依据下列公式计算耐盐指数：
[0079]
[0080] 结果如图6所示，A为表型，B为根长测量统计；可W看出，当幼苗生长在MS平板 中，转基因植株的根长相比野生型植物没有明显的不同。然而，在150mM化C1处理条件 下，转基因植物根长显著长于野生型植物的根长，野生型拟南芥由根长计算来的耐盐指数 为0. 66,而T3代转TaPPDKl拟南芥株系（linel)、（line2)和（line3)的耐盐指数为0. 78、 0. 75、0. 77,转基因植株的耐盐性高于野生型。
[0081] 3、苗期盐胁迫下表型
[0082] (1)Τ3 代转TaPPDKl拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDKl-1 或linel)， P-12-22-18 (35s:TaPPDKl-2 或line2)和P-12-23-30 (35s:TaPPDKl-3 或line3)和野生型 拟南芥（co^O)种子种植于营养±与赔石（1:1)混合上中，每盆种约500粒种子，正常培养 诱水30d后，在托盘底部诱灌350mM化C1水溶液，诱灌2次，每隔7天一次。
[0083] 处理14天后，统计T3代转TaPPDKl拟南芥株系及野生型拟南芥的绿色叶片比率， 结果如图7所示，A为表型，B为统计图，可W看出，野生型拟南芥受到盐胁迫后，叶片失绿严 重，只有49. 3%的叶片保持绿色，而3个转基因株系有82. 3% ,72. 7%和75. 7%的叶片仍然 保持绿色，转基因株系耐盐能力明显高于野生型。
[0084] (2)Τ3代转TaPPDKl拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDKl-l或linel)， P-12-22-18 (35s :TaPPDKl-2或line2)和P-12-23-30 (35s: TaPPDKl-3或line3)和野生型 拟南芥（co^O)种子在MS平板中萌发并生长lOd后移苗至营养±与赔石（1:1)混合上中， 每盆移栽5株，正常培养诱水45d后，在托盘底部诱灌350mM化C1水溶液，处理7天和11 天后，观察T3代转TaPPDKl拟南芥株系及野生型拟南芥的表型，并测定处理7天后拟南芥 植株叶绿素含量。
[0085] 叶绿素含量的测定：植株的叶片被摘下，浸入水中或300mM化C1水溶液中，测量 叶绿素含量。在23°C，14h光照/1化黑暗的光照循环条件，放置36h。80%丙酬萃取叶绿 素，使用DU800分光光度计（Fμllerton，CA，USA)测量663和645皿的吸光率。叶绿素含 量计算公式Chi= 〇). 0802XA663+0. 202XA645)/W，单位为mg/g，其中A663,A645 分别是 叶绿素溶液在波长663nm和645nm处的吸光值。每个株系测定5个植株，W为植株重量。独 立实验重复三次。
[008引结果如图8所示，A为表型，B为统计图，发现盐胁迫7天后，和转基因拟 南芥相比，野生型拟南芥失绿严重，叶绿素含量仅为0. 96mg/g，而T3代转TaPPDKl 拟南芥株系P-12-13-17(35s:TaPPDKl-l)，P-12-22-18 (35s:TaPPDKl-2)和 P-12-23-30(35s:TaPPDKl-3)叶绿素含量为 1. 69,1. 16 和 1. 32mg/g。处理 11 天后，转基因 拟南芥和野生型表型差异更明显（图8A)，转基因株系苗期耐盐能力明显高于野生型。
[0087] 上述实验均表明，TaPPDKl具有提高植物耐盐性的功能。
【主权项】
1. 一种蛋白，是如下1)或2): 1) 序列表中序列2所不的蛋白质； 2) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1) -4)中任一种 的DNA分子： 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子； 2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分 子； 4) 与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至 少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表 达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用。7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表 达盒、转基因细胞系或重组菌在培育高抗逆性植物中的应用。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。 或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。9. 一种培育具有高抗逆性转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分 子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于： 所述抗逆性为抗盐性； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。 或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
【专利摘要】本发明公开了小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，小麦中发现一个新蛋白TaPPDK1，将其导入拟南芥中，转基因植物的抗盐性高于目的植物，为培育抗盐植物提供基础。
【IPC分类】C12N9/12, A01H5/00, C12N15/11, C12N15/54
【公开号】CN105368801
【申请号】CN201510917275
【发明人】姜奇彦, 张辉, 牛风娟, 孙现军, 胡正, 孟强
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月10日