专利名称：从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用。
背景技术：
长期以来，传统的昆虫种类鉴定技术多以成虫的形态特征为依据，无法实现对
非成虫态如卵、幼虫和蛹的鉴定，同时难以区分具有细微差异的近似种。自20世 纪90年代以来，随着现代分子生物学技术的发展，国内外诸多学者已对多种昆虫 进行了分子鉴定方面的探索。利用现代分子生物学进行昆虫鉴定研究时，基因序列 的信息代表了遗传本质，不受标本个体发育状态和环境条件影响，能够提供充分的 可定量测度的遗传学信息。因此，从分子水平上对书虱进行种类鉴定是一种高效、 便捷的方法，尤其是DNA基因序列分析技术的研究与应用，为昆虫分子鉴定揭开了 新的篇章。
世界常见的仓储书虱种类包括嗜巻书虱厶6oW/rc力o/ 力i7aBadonnel、嗜虫书 風厶 e/ fo/z7op力i7a (Enderlein)、无色书風Z. Gfeco/or (Pearman)、小目艮书 虱厶 ； ae力a Pearman、 啮书虱厶 corroofe/ 51 (Heymons)、 暗褐书虱厶力2-〃朋ea Motschulsky以及虚伪书虱L /z e/^ax Pearman。其中，仅啮书虱在我国尚未见发 生报道，且与嗜巻书虱的形态特征极其近似。
发明内容
本发明的目的是提供一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用。 本发明所提供的从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对,其核苷酸序列分别为序列
表中的序列1和序列2。
含有权利要求1所述的引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。 本发明的另一个目的是提供一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法。 本发明所提供的从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法，是以待测仓储书虱的基因组
DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，检测所述PCR扩增产物，所述PCR扩增
产物大小为250-500bp，待测仓储书虱为啮书虱。
其中，检测所述PCR扩增产物的方法可为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测。如果用琼脂糖凝胶电泳检测，由于琼脂糖凝胶电泳的分辨率低，PCR产物大小 在250-500bp之间。
本发明解决了长期以来困扰口岸检疫和粮食储藏部门的书虱种类鉴定问题。由 于书虱个体微小(约lmm)、玻片标本形态特征把握较为困难、国内外书虱形态鉴 定专家屈指可数、鉴定所需时间过长等原因，使书虱形态鉴定存在较大困难。本发 明利用DNA基因序列分析技术，在所构建的7种世界常见仓储书虱16S rDNA基因 序列信息库的基础上，设计、筛选了用于从仓储书虱中鉴别啮书虱的特异引物，建 立了一套从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法，实现了从仓储书虱中快速准确鉴别啮书 虱，将啮书虱与其余世界常见仓储书虱种类区别开来，具有省时、高效、直观等特 点。本发明的从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法可在检验检疫部门和粮食储藏部门广 泛使用。
图1为凝胶电泳检测PCR产物的结果。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途 径获得。
实施例1、利用特异引物通过PCR从仓储书虱鉴别啮书虱 (1)书虱基因组DNA的提取
采用CTAB法分别提取不同地理种群的单头书虱的基因组DNA，包括釆自捷克和 美国的啮书虱、采自中国、捷克、美国的嗜巻书虱、采自中国、捷克的嗜虫书虱、 采自中国、捷克、美国的小眼书虱、采自中国、捷克、美国的无色书虱、采自捷克、 美国的暗褐书虱以及采自中国的虚伪书虱。上述书虱的种类均经形态特征确证。
取待检书虱单头用无水乙醇杀死后，用双蒸水清洗晾干(勿干透)，放入1.5mL 无菌离心管中，加入50pl提取缓冲液(100 mmol/L Tris-HC1， pH 7. 0， 1. 4 mol/L NaCl， 20mmol/L EDTA， 2g/100ml CTAB)研匀；加入lpl蛋白酶K(20 mg/mL)，置 于60°C水浴锅中保温1 h，其间上下混匀3次；加入125pl苯酚氯仿异戊醇 (25 : 24 : 1)混匀5 min，放入离心机中，10000 r/min离心15 min后取上清液； 加入2倍体积的冰冷无水乙醇和0. 1倍体积的3 mol/L醋酸铵(pH 7. 0)，混匀后置 于-20°C 8 h以上。14000 r/min离心10 min，用100^1 70%乙醇洗涤1次，37°C 干燥后，加入灭菌水lO)il室温下溶解DNA。然后置于-2(TC保存待用。
4(2) PCR扩增
利用16S rDNA基因片段通用引物16Sar 5， GCCTGTTTAACAAAAACAT3， ， 16Sbr 5' CCGGTCTGAACTCAGATCACGT3， 扩增上述书虱16S rDNA基因片段，PCR扩增产物 送公司双向测序(北京奥科生物技术有限责任公司)。测序结果用DNAman比对分 析后，用Primer Premier 5.0软件设计针对啮书虱的特异引物。
针对啮书虱的特异引物如下
上游引物5' AAGTTTCATTTTCTMTTTCCCCAAT 3'(序列表中的序列1);
下游引物5' TCAAGTCGMTCTGCCCACT 3'(序列表中的序列2)。
以(1)提取的书虱基因组DNA为模板，用上述特异引物进行PCR扩增。
PCR反应体系总体积为20叱10叱2XTaq PCR Master Mix (天根生化科技(北
京)有限公司);舰ddH20; 0. 5ML上游引物，0. 5叱下游引物，引物浓度分别为訓;
l叱模板DNA。
PCR反应循环参数94°C 3 min， 94°C 30 sec， 52°C 30 sec， 72°C30 sec， 30个循环；72。C 10 min。
取5Mi PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中电泳，溴化乙锭(EB)染色， 在凝胶成像系统(Syngene G-box)中观察并成像分析。
分析结果如图1所示，表明采自两个国家的啮书虱的PCR扩增产物大小为 250-500bp。其它仓储书虱均未得到PCR产物。图1中，M: DNA相对分子量标准；1: 采自捷克的啮书虱；2:采自美国的啮书虱；3:采自中国的嗜巻书虱；4:采自捷 克的嗜巻书虱；5:采自美国的嗜巻书虱；6:采自中国的小眼书虱；7:采自捷克 的小眼书虱；8:采自美国的小眼书虱；9:采自中国的无色书虱；10:采自捷克的 无色书虱ll:采自美国的无色书虱12:采自中国的嗜虫书虱；13:采自捷克的嗜 虫书虱；14:采自捷克的暗褐书虱；15:采自美国的暗褐书虱16:采自中国的虚 伪书虱；17:对照，水。
上述实验结果说明，用本发明的特异引物可以从仓储书虱中鉴别啮书虱。序列表
〈160〉 2
<210> 1 〈211〉 26 <212> DNA 〈213〉人工序列
〈220> <223>
<400〉 1
aagtttcatt ttctaatttc cccaat 26
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 2
tcaagtcgaa tctgcccact 20
权利要求
1、从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对，其核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。
2、 一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的试剂盒，包括权利要求1所述的引物对。
3、 一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法，是以待测仓储书虱的基因组DNA为模 板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，检测所述PCR扩增产物，如果所述PCR 扩增产物大小为250-500bp，待测仓储书虱为啮书虱。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于检测所述PCR扩增产物的方法为 琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述仓储书虱为嗜巻书虱、 嗜虫书虱、无色书虱、小眼书虱、啮书虱、暗褐书虱或虚伪书虱。
6、 权利要求1所述的引物对在从仓储书虱中鉴别啮书虱中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用。从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对，其核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。本发明还公开了利用该引物对从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法。该方法是以待测仓储书虱的基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，检测所述PCR扩增产物，如所述PCR扩增产物大小为250-500bp，待测仓储书虱为啮书虱。本发明的从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法实现了啮书虱的快速准确鉴定，将啮书虱与其余世界常见仓储书虱种类区别开来，具有省时、高效、直观等特点。本发明的方法可在检验检疫部门和粮食储藏部门广泛使用。
文档编号C12Q1/68GK101608238SQ200910090168
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者李志红, 朔 赵 申请人:中国农业大学