Cntn4基因snp位点的应用及其检测引物与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及CNTN4基因 SNP位点的应用及其检测引物与试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 阅读障碍是一个基于特定神经组织的发育障碍，表现为阅读和拼写能力损伤，且 不能通过认知能力发育迟缓或智力低下来解释。发展性阅读障碍是学龄儿童中最常见的一 种学习障碍，且可W延续至成人期，可对其社会适应性造成影响。中国学龄期人群阅读障碍 发生率为4%到13%。国际上普遍认为阅读障碍是遗传因素和环境因素综合作用的结果。
[0003] 现有技术中，对阅读障碍的诊断标准主要参照文献Siok，W.T.，Niu，Z.，Jin，Z.， Perfetti,C.A.&Tan,L.H.A structural-functional basis for dyslexia in the cortex of Qiinese readers.Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.105,5561-6(2008)。按照语文 成绩，阅读成绩和瑞文评分进行筛选。该方法操作繁琐、耗时较长。
[0004] 单核巧酸多态性（Single Nucleotide Polymo;rphism,SNP)是由单个核巧酸的改 变而引起的DNA序列的改变，造成染色体基因组的多样性。SNP分布广、密度高，已成为继限 制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星即短串联重复(STR)标志后的第S代遗传标志， 在肿瘤、糖尿病等复杂疾病的研究中起重要作用。其中，全基因组关联分析(Genome Wide Association Study,GWAS)是研究运类复杂疾病易感基因的重要手段。
[0005] 遗传学研究表明遗传因素对阅读障碍有很大影响，约占整个表型变异的45%~ 75%。目前国内外不同人群的阅读障碍易感性研究，大部分是基于候选基因的研究，但国外 人群的全基因关联分析研究，尚未发现具有显著意义的基因位点。而一些候选基因（如 DYXlCl，DCDC2，KIAA0319，ROBOl，KIAA0319L，D0CK4，DRD2，ATP2C2，CMIP，GNPTAB，GNPTG和 NAGPA)在中国人群中有验证研究。但是，中国人群的阅读障碍的全基因关联分析研究尚无 报道，中国人群中也还没有一个大规模系统的阅读障碍全基因组关联分析研究，因而缺乏 针对中国人阅读障碍的易感位点。因此，亦尚无针对中国人群的阅读障碍易感基因检测试 剂盒。
[0006] 因此，在中国人群中在全基因组层面研究阅读障碍的易感基因，并且对相关易感 位点进行检测，对于提高我国人口素质，降低阅读障碍的发生率将具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供CNTM基因 SNP位点的应用及其检测 引物与试剂盒，本发明提供的引物与试剂盒适用于中国人群，准确性良好。
[000引本发明提供了 CNTN4基因 SNP位点rs 12636975在制备评估人群阅读障碍风险的产 品中的应用。
[0009] 本发明提供的CNTN4基因 SNP位点rs 12636975对评估中国人的人群阅读障碍风险 具有更好的特异性。
[0010] 阅读障碍影响着人的生活、学习和事业，本发明研究发现，人群阅读障碍风险与基 因类型有关，特别是CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的基因型与阅读障碍关系密切。在阅读 障碍全基因组关联分析研究方面，本发明是第一个完全W中国一般人群为研究对象，本发 明通过分析4338个学龄儿童，发现一个新的SNP位点rsl2636975与阅读障碍达到全基因组 关联分析显著水准(2.31 X 1(T8)，该位点位于CNTN4基因上。该基因位于3号染色体短臂，编 码轴突相关细胞粘性因子即接触蛋白-4。现有研究提示CNTM基因与神经发育异常有关，如 自闭症等。本发明研究发现，CNTM基因 SNP位点rsl2636975的基因型为TT或TC,则低阅读障 碍风险;CNTM基因 SNP位点rs 12636975的基因型为CC，则高阅读障碍风险。由于本发明的研 究结果来自于中国人群，具有很强的中国人群适应性，且样本量为目前最大的研究。
[0011] 本发明还提供了一种评估人群阅读障碍风险的方法，根据CNTN4基因 SNP位点 rsl2636975的基因型评估人群阅读障碍风险；
[0012] CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的基因型为TT或TC,则低阅读障碍风险；
[0013] CNTM基因 SNP位点r S1263697 5的基因型为CC，则高阅读障碍风险。
[0014] 对CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的基因型检测的方法可采用现有技术中的多种 SNP检测技术，包括但不限于微阵列忍片法、Taqman法、质谱法、测序法、微测序、高分辨率溶 解曲线法或联合应用W上方法。
[0015] 在本发明中，CNTM基因 SNP位点rsl2636975的基因型的检测方法包括：
[0016] 步骤1: W待测样品的基因组DNA为模板，WSEQ ID NO: 1所示核巧酸序列的上游引 物和SEQ ID NO:2所示核巧酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0017] 步骤2:扩增产物经纯化后，WSEQ ID N0:3所示核巧酸序列的单碱基延伸引物进 行延伸，获得延伸产物；
[001引步骤3:延伸产物经纯化后，测定CNTM基因 SNP位点rsl2636975的基因型。
[0019]作为优选，步骤1中所述扩增体系中每个反应体系提及为化1，具体包括= IOXPCR buffer 0.化l，MgCl2(25mM)0.4山，dNTP mix(25mM)0.1iil，HotStar 化9(抓AU)0.化1，无 酶水1.化1，PCR primer mix化1，待测DNA样品化1。
[0020]作为优选，待测样品的基因组DNA溶液的浓度为20-5化g/化。
[0021 ]作为优选，步骤1中所述扩增的程序为： 94V 4風扣; 94V 20 s, ^ 56C 30 S，^共45个循环
[0022] 72 r 1 min; J ITC 3 min ; 4 V 保持。
[0023] 作为优选，步骤2中所述纯化为去除游离dNTPs，采用邮碱性憐酸酶处理。
[0024] 邮碱性憐酸酶处理的体系包括:5化扩增产物，1.5化1无酶水，0.1化1 SAP Buffer (10X)，0?姐I SAP Enzyme(1.7U/]il)D
[0025] 邮碱性5葬酸酶处理的反应条件为37。(：鹏育40min，85DC保持5min，4DC保持。
[0026] 作为优选，步骤2中所述延伸的体系为:无酶水0.61邮1，单碱基延伸引物0.9仙I， iPLEX Buffer plus 0.2]il,iPLEX terminator 0.2]il,iPLEX enzyme0.041]il〇
[0027] 作为优选，步骤2中所述延伸的程序为： I. 94〇C 30 S； II. WC 5 s； 助.链°0 5南 扔 8CTC 5 s;
[002引 乂返回姐，4个循巧； VX返田II，39个循环； 3min, w.cc 保持。
[0029] 作为优选，步骤3中所述纯化采用树脂纯化。
[0030] 经树脂纯化后，经忍片点样，质谱分析，结果用TY阳R4.0软件(Sequenom)分型并输 出结果。
[0031] 本发明提供的方法能够准确检测CNTM基因 SNP位点rsl2636975的基因型，所用引 物具有良好的特异性。
[0032] 本发明还提供了扩增CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的扩增引物对及单碱基延伸 引物；
[0033] 扩增引物对的核巧酸序列如SEQ IDNO: 1~2所示；
[0034] 单碱基延伸引物的核巧酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0035] 本发明还提供了评估阅读能力的试剂盒，包括扩增CNTM基因 SNP位点rsl2636975 的扩增引物对及单碱基延伸引物；
[0036] 扩增引物对的核巧酸序列如SEQ IDNO: 1~2所示；
[0037] 单碱基延伸引物的核巧酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0038] 作为优选，本发明提供的试剂盒还包括化q酶、邮碱性憐酸酶、邮碱性憐酸酶缓冲 液和无酶水。
[0039] 通过本发明的试剂盒可W快速简便地对中国人群进行阅读障碍易感性的筛查，能 有效地起到预警风险，从而预防和降低阅读障碍的发生。检测手段经济便捷，有利于在人群 中大范围推广。
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