Pcdh17基因的应用的制作方法

专利名称：Pcdh17基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，具体涉及ー种P⑶H17基因的应用。
背景技术：
胃肠肿瘤是人类最常见的恶性肿瘤，据统计胃肠肿瘤约占全世界总肿瘤的20%。胃癌和大肠癌在世界范围内的发病率仍位居第三至四位，其在癌症导致的死亡率中也占据第ニ到三位。尽管以手术、化疗、放疗为主体的肿瘤综合治疗已经显著改善和提高了胃肠道肿瘤患者的治愈率，但目前对于胃肠道肿瘤的早期诊断和早期治疗还缺乏特异性的检测手段和治疗方法，因此寻找一种新的肿瘤标志物显得十分迫切。目前的研究已经发现胃癌的发生经历萎缩一化生一非典型增生ー癌四个阶段；结直肠癌的发生经历腺瘤一腺癌两个阶段。在胃肠道肿瘤的这种表型演变过程中，表观遗传修饰尤其是DNA甲基化扮演着ー个重要的角色。DNA甲基化常常导致选择性基因的启动子区域过度甲基化和某些抑癌基因的表达沉默。目前的研究认为，肿瘤抑癌基因的表观遗传调控失调在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要的作用。新的甲基化基因的鉴定能够为肿瘤的监测、预防、诊断和治疗提供ー种新的策略。PO)Hs (protocadherins)是cadherins超家族中的新的亚群,但它们的功能却与cadherins有明显的不同。Cadherins是ー组与细胞粘附能力相关的膜蛋白，它们的主要功能是介导Ca2+依赖的细胞粘附。而目前越来越多的研究表明PCDHs的主要功能并不是介导细胞粘附而是促进细胞内的信号传导和细胞间的相互作用。到目前为止，在人类和动物中已经发现70多种protocadherin基因。根据基因结构不同，这些基因被分为成簇的protocadherins、非成族的protocadherins和其它类型的protocadherins三类。成族的protocadherins 主要包括 a-protocadherin、旦-protocadherin、Y-protocadherin 三型；非成族的 protocadherins 进一步被分 S 1-protocadherin 和 S 2-protocadherin 两个亚类。这些新发现的protocadherin基因被报道具有调控神经细胞生长和抑制肿瘤形成的作用，而且越来越多的研究显示这些基因中的某些基因在肿瘤的发生和发展中扮演着抑癌基因的角色，它们的存在能够抑制肿瘤的发生。表观遗传学作为肿瘤形成和发展过程中的一个决定因子在近年来受到了越来越多的关注。表观遗传修饰的机制有很多，其中DNA甲基化是最重要的ー种方式。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases , DNMTs)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等，哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’ -CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG 二核苷酸在基因中的分布并不是均一的，一般分为两种形式ー种是分散于DNA中，另ー种是CpG结构高度聚集的CpG岛。在人类基因组中，大约70%的基因启动子区有CpG岛存在，一般在0.5 3Kb不等，常位于基因的5’端启动子区域，也可延伸至基因的外显子区域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而CpG序列中的C-5的甲基化可导致基因转录被抑制。对于很多基因来说，基因内部区域的甲基化与基因沉默没有关联，只有将启动子CpG岛区域甲基化才能导致其表达沉默。DNA甲基化在基因突变，基因表达调控，细胞増殖、分化和发育等方面起重要作用。尽管DNA甲基化的精确分子机制尚未阐明，但是肿瘤抑癌基因通过启动子甲基化而导致的基因表达沉默已经被证明在肿瘤的发生和发展过程中扮演着重要的作用。在肿瘤细胞中甲基化模式表现为全基因组广泛的低甲基化伴随某些基因(如肿瘤抑癌基因)启动子CpG岛区域的高度甲基化。低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及增加染色体的不稳定性；同时，在整体低甲基化的水平下，某些肿瘤抑癌基因发生高度甲基化，导致基因表达沉默，最終诱发肿瘤。既往我们的研究显示在胃肠道癌组织和癌旁组织中某些肿瘤抑癌基因的启动子被甲基化，这提示DNA甲基化可能与肿瘤发生的多个阶段相关。而且这些甲基化的基因在不同的肿瘤组织中表达不同，因此这些甲基化基因的鉴定将为肿瘤的预防、监测和治疗提供一种新的策略。 PCDHl7 (protocadherin 17)是 3 2-protocadherin 家族的一员，它已经被报道在正常胃粘膜组织和胃癌组织以及正常肠粘膜组织和结直肠肠癌组织中的甲基化状态呈明显差异，但是其在胃癌和结直肠癌中的生物学功能以及其与胃癌和结直肠癌发生、发展的分子机制目前还不清楚。此外，PCDH17也被报道在食管癌中高度甲基化且甲基化的PCDH17与食管癌的低分化有夫。在食管癌细胞株中重表达PCDH17后，食管癌细胞的増殖和迁移能力降低，这进ー步说明TODH17可以抑制食管癌的发生。我们通过MSP (MethylmionSpecific PCR)也证实在胃肠肿瘤中KDH17的启动子常常发生甲基化。基于上述研究基础，我们认为PCDH17在胃肠肿瘤中可能扮演着抑癌基因的角色，但其在胃肠肿瘤中的生物学功能和可能的作用机制尚未阐明。

发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供PCDH17基因的新应用，一方面该基因可作为胃癌和结直肠癌早期诊断的标志物，有利于胃癌和结直肠癌的早期监测和预防，另一方该基因可作为胃癌和结直肠癌化学治疗敏感性检测的新靶点，有利于指导胃癌和结直肠癌的化学治疗。所述的ー种PCDH17基因在制备诊断胃癌和结直肠癌的产品中的应用。所述的ー种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的诊断胃癌和结直肠癌的产品包括用RT-PCR或甲基化特异性PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品。所述的ー种P⑶H17基因的应用，其特征在于所述的用RT-PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品至少含有ー对特异扩增PCDHl7基因的引物。所述的ー种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的用甲基化特异性PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品至少含有ー对特异扩增PCDHl7基因的引物。所述的ー种P⑶H17基因的应用，其特征在于所述的用RT-PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品中特异扩增TODH17基因的引物序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示。所述的ー种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的用甲基化特异性PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品中特异扩增TODH17基因的引物如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示。所述的ー种PCDH17基因作为胃癌和结直肠癌化学治疗敏感性检测新靶点的应用。
本发明证明P⑶H17在大多数肿瘤细胞和肿瘤组织中表达沉默或降低，而且在这些表达沉默或降低的肿瘤细胞和肿瘤组织中P⑶H17均被检测到高度甲基化，但在胃肠道正常粘膜组织中P⑶H17却未被检测到甲基化的发生。P⑶H17蛋白在胃肠道正常粘膜组织中呈高表达(正常胃粘膜组织中高表达率100% ;正常肠粘膜组织中高表达率90%)，而在大部分胃肠肿瘤组织中出现表达缺失(仅16. 7%的胃癌样本显示低表达；16%的肠癌样本显示低表达)。P⑶H17蛋白的表达与结直肠癌的低分期(P=O. 027)和较少的淋巴结转移(P=O. 039)显著相关。细胞株转染P⑶H17后，通过体内外实验发现P⑶H17能抑制肿瘤细胞的生长、促进5-FU诱导的肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞出现自噬现象。本发明PCDH17基因为胃肠肿瘤的早期诊断提供了ー种新的标志物，同时为增强胃肠肿瘤化学治疗的效果提供了ー个新的靶点。


图IA是实施例I中P⑶H17在所有正常成人组织中均表达示意图。图IB是实施例I中P⑶H17在胃癌和肠癌细胞株中的表达被沉默或下调表达示意图。图IC是实施例I中表示KDH17 CpG岛的序列图，其中共有37个CpG岛位点被分析，甲基化特异性PCR (MSP)和亚硫酸盐基因序列区域(BGS)也被包含在图中。图2是实施例5中P⑶H17蛋白在正常胃、结肠粘膜和和它们的原发肿瘤组织中的表达情况图。其中(A) P⑶H17在正常胃粘膜(a)和原发胃癌组织(b、c)中的表达情況；(B)P⑶H17在正常结肠粘膜(d)和原发结直肠癌组织(e、f)中的表达情況；(C) P⑶H17在结直肠管状腺瘤(g)、锯齿状腺瘤(h)和绒毛状腺瘤(i)组织中的表达情況。放大倍数200X。图3是实施例10中肿瘤细胞经5-FU处理16h后，各组细胞荧光显微镜下形态观察图。图4是实施例11中流式细胞仪检测P⑶H17对肿瘤细胞凋亡的影响分析图。图5A是实施例13中免疫荧光观察分析图。图5B是实施例13中流式细胞仪检测分析图。图6是实施例14代表性的GFP-LC3B转染后细胞自噬的观察结果图。图7是实施例15 Western-blot检测P⑶H17对自噬相关通路关键蛋白的影响图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进ー步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I P⑶H17的表达水平和甲基化状态检测。I.组织分离
人胃肠组织标本均取自浙江大学附属邵逸夫医院2004年2月至2006年6月未行新辅助治疗而直接手术切除、病理证实为原发腺癌的患者，经病人知情同意后获得患者的手术标本。每个手术标本包括肿瘤组织、癌旁组织和对应的远肿瘤的正常组织(距肿瘤5 cm以上)。从手术室获取胃肠组织标本后，每个部位的标本立即分成3个部分，2个部分立即置于、液氮中进行保存，其中I个部分用于提取RNA，另I部分用于提取蛋白。第3部分置入福尔马林中固定24 h，然后送到病理科进行石蜡包埋，以待后用。本研究选取术后原发胃癌标本99例(任选36例行免疫组化)，正常胃粘膜标本10例，原发结直肠癌标本96例(任选50例行免疫组化)，结直肠腺瘤标本30例管状腺瘤10例(病理类型为轻度或中度非典型增生、锯齿状腺瘤10例(病理类型为低级别上皮内瘤变)、绒毛状腺瘤10例(病理类型为低级别上皮内瘤变)，正常结肠粘膜标本10例。2.提取总 RNA
采用Trizol抽提法提取细胞或组织总RNA。3.逆转录
RT-PCR采用美国Promega公司试剂，按试剂说明书进行，得到cDNA产物保存于_20°C备用。4.聚合酶链反应
获取检测目的基因核苷酸序列，通过软件设计PCR引物，经Blast进行同源性分析证实其特异性，设计合成 PO)H17 引物。PCDH17RT-F :CGGAGGTGATGTATCTCAAA (SEQ ID NO:I) ;PCDH17RT-R :CAGGAGCCTTTGTTAGTGTC (SEQ ID NO :2)。GAPDH 引物作为对照内參引物:GAPDH-F TCCTGTGGCATCCACGAAACT (SEQ ID NO 3)；GAPDH-R GAAGCATTTGCGGTGGACGAT (SEQID NO :4)。取2 ill进行逆转录所得cDNA进行PCR扩增，使用25 U I反应体系，如下无核酶水15. 875 u I ； 10 X buffer 2. 5u I ；MgC12 (25mM) 1. 5u I ；dNTP (2. 5mM) 2u I ;上游引物(IOiiM) 0. 5u I ;下游引物(IOiiM) 0. 5u I ；cDNA 2u I ;Taq 酶(5U/iU) :0. 125 yl。采用温度梯度PCR，具体的循环參数为95°C变性IOmin ;94°C 30sec，60 50°C30sec,72°C 30sec, 10 个循环，94で 30sec,50°C 30sec,72°C 30sec, 30 个循环；末次延伸72°C 7min，之后进入4°C維持。循环完成后，取IOiU PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，成像，分析結果。5.甲基化特异性PCR (MSP)
5. I提取组织基因组DNA
用全基因组DNA提取试剂盒(天根，中国)提取组织基因组DNA，按照说明书进行操作。冷冻保存的组织标本，约50 lOOmg，在液氮环境下用研钵迅速将其研磨成细小均匀之粉末，将粉末倒入含1.5ml的Eppendorf管中。加入20yl蛋白酶K混匀，然后加入200 yl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C水浴lOmin，溶液变清亮，简短离心去除内壁水珠，加入200 Ul无水こ醇，充分震荡混匀15秒，可出现絮状沉淀，简短离心去除内壁水珠，将EP管中所有物都加到柱CB3中，12000rpm离心30秒，弃去离下的废液，向柱CB3中加入500 y I⑶(已加入こ醇)，12000rpm离心30秒，弃去离下的废液，向柱CB3中加入700 U I漂洗液PW(已加入こ醇)，12000rpm离心30秒，弃去离下的废液，再向柱CB3中加入500 U I漂洗液PW(已加入こ醇)，12000rpm离心30秒,弃去离下的废液，12000rpm空离2min。将柱CB3置于干净EP管内，向吸附膜中间部分加入50-200 u I洗脱液TE，室温放置2_5min，2000rpm离心2min，收集所提取的DNA。
5. 2重亚硫酸盐处理DNA
上述基因组DNA，用德国Qigen公司的甲基化试剂盒进行重亚硫酸盐处理，操作按照说明书进行，得到DNA。5. 3甲基化引物
DNA经重亚硫酸盐处理后，已甲基化的胞嘧啶不变，而未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。利用这ー原理，我们在同一位点设计两对引物，一对针对甲基化的序列，另ー对针对非甲基化的序列。PCDH17-mF GATTATCGGGTGTCGTAG TTC (SEQ ID NO :5) ;PCDH17_mR CCCTAACGCAACGTACGCGCSEQ ID NO :6)。PCDHl7_uF :AGATTATTGGGTGTTGTAGTTT(SEQ ID NO:7) ;PCDH17-uR :AACCCTAACACAACATACACA (SEQ ID NO :8)。5.4甲基化特异性PCR(MSP) 使用 25 u I 体系进行扩增无核酶水13. 375 u I ； 10 X buffer 2. 5u I ；MgC12 (25mM)2u I ；dNTP (2. 5mM) 2u I ;上游引物(IOyM) 1. 5u I ;下游引物(IOyM) 1. 5u I ；DNA 2u I ； Taq-Go Id (5U/u I) :0. 125 ii I。PCR 具体的循环參数为95°C IOmin ；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35 个循环；末次循环延伸时间为72°C lOmin，然后进入4°C維持。循环完成后，取IOyl PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，成像，分析結果。实验结果显示，通过半定量RT-PCR检测了 21种正常成人组织、17株胃癌细胞株和9株肠癌细胞株中P⑶H17的表达水平。结果显示P⑶H17在所有正常成人组织中均有不同程度的表达(21/21)(图I A);但在17株胃癌细胞株中仅有2株表达P⑶H17，其余胃癌细胞株中PCDH17的表达被完全沉默；在9株肠癌细胞株中，仅DNMTs被敲除的细胞株HCTl 16/DKO表达KDH17，其余肠癌细胞株中P⑶H17的表达亦被完全沉默(图I B)。这说明KDH17在绝大多数胃肠道肿瘤细胞株中表达沉默或下调。基于P⑶H17的CpG岛序列(图I C)，我们设计了相应的MSP引物来分析PCDH17 CpG岛的甲基化状态。所有PCDH17表达沉默或下调的肿瘤细胞株均检测到CpG岛被甲基化。这说明PCDH17在大多数胃肠道肿瘤细胞株中表达沉默或下调与该基因的CpG岛发生甲基化相关。实施例2去甲基化试剂5-Aza和组蛋白去こ酰化酶抑制剂TSA处理细胞。将P⑶H17表达沉默的细胞株接种于直径IOcm的培养皿中，每皿接种I X 106个细胞。待过夜培养后，细胞被去甲基化试剂5-Aza (终浓度IOii mol/L)处理三天，再用组蛋白去こ酰化酶抑制剂TSA (终浓度300nmol/L)处理24小吋。最后收集上述被处理的细胞，提取DNA和RNA备用。实验结果显示，P⑶H17表达沉默的胃癌细胞株YCCEL1、SNU719和肠癌细胞株HCT116、SW480用5_Aza和TSA处理后，再次提取RNA和DNA检测P⑶H17的表达水平和甲基化状态，结果发现四株细胞中PCDH17的表达均被不同程度的修复，这说明DNA甲基化是导致胃肠道肿瘤细胞中P⑶H17表达沉默的原因。实施例3代表性的BGS結果。我们通过BGS检测了 P⑶H17基因中37个CpG岛位点的详细甲基化图谱，被检测的37个CpG岛位点也包括经MSP分析的CpG岛位点。结果显示在正常胃粘膜组织和DNMTs被敲除的细胞株HCTl 16/DK0中，P⑶H17 CpG岛的甲基化发生率非常低，而在不表达P⑶H17的胃癌细胞株YCCELl、SNU719和肠癌细胞株HCTl 16、SW480中浓密的甲基化CpG岛位点被大量检测到。而且使用5-Aza和TSA处理不表达P⑶H17的胃癌细胞株YCCELl、SNU719和肠癌细胞株HCTl 16、SW480后再次检测CpG岛的甲基化状态，BGS结果显示P⑶H17 CpG岛位点明显被去甲基化，这与实例I MSP结果相一致。该实验结果提示P⑶H17 CpG岛位点的甲基化与该基因的表达沉默明显相关。实施例4 MSP检测正常组织(N)和肿瘤组织(T)中P⑶H17的甲基化水平。我们通过MSP检测了 10例正常胃粘膜组织、10例正常结肠粘膜组织、99例原发胃癌组织和96例原发结直肠肠癌组织中P⑶H17的甲基化状态。结果显示正常胃和结肠粘膜组织中未检测到P⑶H17基因的甲基化；而在所有癌组织中，P⑶H17均被检测到发生甲基化，这说明PCDH17的甲基化状态与肿瘤的发生密切相关。
实施例5免疫组化检测P⑶H17的表达水平并分析与胃肠道肿瘤患者临床病理特征的相关性。I脱蜡和水化、2抗原修复暴露抗原决定族、3阻断内源性过氧化物酶、4去除其他非特异性背景、5 —抗孵育、6 ニ抗孵育、7显色、8复染、脱水、透明、封片。统计学分析
本研究的统计学分析应用SPSS16. 0完成。计量数据采用均数土标准差(SD)或均数土标准误(SE)描述，组间比较采用方差分析完成。P⑶H17表达水平与肿瘤样本临床特征相关性分析用two-tailed Chi-squaretest完成。对于PO)H17表达水平与肿瘤患者生存相关性分析，各组间差异通过log-rank tset比较,并通过Kaplan-Meier绘制生存曲线。P〈0. 05时认为差异具有统计学意义。我们通过免疫组化检测了 10例正常胃粘膜组织，10例正常结肠粘膜组织，36例原发胃癌组织，30例结直肠腺瘤组织管状腺瘤10例(病理类型为轻度或中度非典型增生、锯齿状腺瘤10例(病理类型为低级别上皮内瘤变)、绒毛状腺瘤10例(病理类型为低级别上皮内瘤变)和50例原发结直肠癌组织中P⑶H17蛋白的表达水平。代表性的免疫组化染色结果见图2。研究发现，P⑶H17在正常胃、结肠粘膜的上皮细胞的细胞膜、细胞质以及ー些间质细胞中高表达，反而在大部分原发胃癌和肠癌组织中表达缺失。与所有正常胃、结肠粘膜中P⑶H17的高表达相比较，胃癌中仅有16. 7% (6/36)显示P⑶H17低表达，肠癌中仅有16% (8/50)显示PCDH17低表达。有意思的是，在结直肠管状腺瘤和结直肠锯齿状腺瘤中P⑶H17的阳性表达率与正常结肠粘膜中P⑶H17的阳性表达率相仿，而在结直肠绒毛状腺瘤中P⑶H17的阳性表达率与原发结直肠癌组织中P⑶H17的阳性表达率相仿。这些实验结果给我们提示PCDH17甲基化可能发生在肿瘤发生的早期，其表达水平愈高，肿瘤的恶性程度愈低。其次我们分析了 PCDH17蛋白的表达水平与胃肠道肿瘤患者临床病理特征的相关性。结果发现在结直肠癌组织中，P⑶H17蛋白的表达与结直肠癌的低分期(P =0. 027)和较少的淋巴结转移(P =0. 039)具有明显相关性，但在胃癌中，统计结果并未显示P⑶H17的表达水平与胃癌样本的临床特征相关(P > 0. 05)，这可能与样本量较小有夫。根据上述实施例1-5结果，表明P⑶H17在胃肠道肿瘤中扮演抑癌基因的角色，该基因的表达能够抑制肿瘤细胞的増殖；而且PCDH17甲基化在胃肠道肿瘤中是ー个经常发生的、肿瘤特异的分子事件。正常结直肠粘膜组织中P⑶H17蛋白的阳性表达率与结直肠管状腺瘤和锯齿状腺瘤组织中PCDH17蛋白的阳性表达率相仿；而在结直肠癌组织中PCDH17蛋白的阳性表达率与结直肠绒毛状腺瘤组织中PCDH17蛋白的阳性表达率相仿。这说明，P⑶H17表达沉默可能主要发生在结直肠癌形成的早期，其表达水平愈高肿瘤的恶性程度愈低。因此PCDH17具有作为ー个肿瘤标志物用于结直肠癌的早期诊断和癌变风险评估的潜倉^:。实施例6 P⑶H17转染后对肿瘤细胞增殖能力的影响 脂质体介导的质粒转染及克隆筛选
(OG418筛选浓度的确定将5X IO4个生长良好的MKN45和HCTl 16细胞接种于24孔板，分别在含10% FBS的RPML1640培养液和McCOY’ s 5A培养液中培养24小时后，按不同浓度加入 G418，共设 8 个浓度梯度，分别为 0,31. 25ii g/ml、62. g/ml、125ii g/ml、250ii g/ml>500 v- g/ml>1000 u g/ml和2000 u g/ml,姆个浓度设3个复孔,培养液姆3天更换一次，并于倒置显微镜下观察细胞生长情況。培养10天后，取同一浓度的三个复孔内细胞全部死亡的最低浓度作为以后筛选的G418工作浓度。若选取的浓度与相邻较低浓度跨度较大，则在两个浓度间再取多个浓度重复筛选。
(2)稳定转染脂质体介导的质粒转染采用美国OriGene公司Mega tranl. 0系统完成，操作按照试剂盒说明书进行。转染前I天，取处于对数期生长的MKN45和HCT116细胞5. 0 X IO5个细胞接种于6孔培养板，培养过夜，使转染当天细胞的融合度达到50-70%左右。转染时，在0.6ml的Eppendorf管中加入IOOiU 0PTI-MEM和3 y g的质粒，混勻，然后加入9iil的Mega tranl. 0，涡旋振荡10秒，室温静置10分钟，然后逐滴加入培养孔内并轻轻摇动使其尽量混匀，然后放入细胞培养箱内培养。(3)克隆筛选转染24小时后，转染细胞按一定比例稀释接种于直径IOcm的培养皿中，用含筛选工作浓度G418的培养液进行筛选培养，培养液3天更换一次，一般10天左右，未转染的对照组细胞在G418作用下全部被杀死，而转染组细胞可以看到部分耐药克隆开始形成集落。在集落的细胞个数达到50个左右时，选择相对孤立的克隆，在无菌操作台上将克隆挑至新的培养器皿内培养，培养过程中应用含较低浓度(通常为筛选工作浓度的1/2左右)G418的培养液，以防止丧失G418抗性的细胞的聚集。通过培养和传代，获得足够的克隆细胞，提取相应的RNA和蛋白，分析转染效果，选择PCDH17高表达的细胞作为研究对象。克隆形成实验
克隆形成实验是測定单个细胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是细胞在体外持续增殖6代以上，其后代组成的细胞群体，称为克隆或集落，这时每个克隆含50个以上的细胞，直径在0. 3-1_之间。通过计数克隆形成率，对单个细胞的増殖潜力作定量分析，了解细胞的増殖力和对环境的适应性。克隆形成能力高者独立生存能力強。常用的方法有平皿克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。(I)平板克隆形成实验
取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在10%的基础培养液中，计数。取1000个细胞接种至直径IOcm的培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，然后置于37°C、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心清洗2次。用1%戊ニ醛固定15分钟。然后去除固定液，加适量0. 25%结晶紫染色液，染色15 20分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加ー张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆数。每株细胞重复实验三次。(2)软琼脂克隆形成实验
取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在10%胎牛血清的基础培养基中，计数，并调细胞浓度为30，000个/ml，备用。将2. 5%低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.5%的底层琼脂，6孔板中每个孔2ml，温室凝固。将0.5%的底层琼脂与IX细胞培养基以2:3的体积比混合，制备0. 3%的上层琼脂，每孔加Iml上层琼脂和100 ill单细胞悬液(约3000个细胞/孔)，混匀，室温凝固。每孔加入Iml培养液，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养2 3周。低倍镜下计数含50个细胞以上的克隆，每株细胞选取5个视野。实验重复三次。通过平皿单克隆形成实验和软琼脂集落形成实验，我们发现与野生细胞株和转染空载体的细胞株对比，转染PCDHl7的肿瘤细胞株的增殖能力明显下降，这提示PCDHl7可以抑制胃癌和肠癌细胞株的増殖，同时也进一步说明了 PCDH17是ー个抑癌基因。实施例7 P⑶H17转染后对细胞周期的影响 流式流式细胞仪检测细胞周期
流式细胞仪检测细胞周期采用PI染色试剂盒(中国凯基公司)进行。操作按试剂盒说明书进行。将原细胞培养液去除，PBS洗涤贴壁细胞一次，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，2000rpm离心5分钟。弃去上清，用I XBufTer A洗涤细胞一次，收集并调整细胞浓度为I X IO6个/mL。细胞加9倍体积的70%こ醇，于_20°C固定至少12小吋。离心收集细胞后，用IXBuffer A洗涤细胞除去こ醇，然后用500 的Buf f er A重悬细胞。往细胞悬液中加入RNaseA，使RNaseA终浓度为0. 25mg/ml，轻轻弹动管底使混匀，37°C，反应30分钟。加入5 ill的PI，轻轻弹动管底使混匀，室温避光染色30分钟。随即进行流式细胞仪检测，激发波长选择488nm。实验重复三次。我们通过流式细胞仪进ー步分析了 P⑶H17对细胞周期的影响，在HCT116细胞株中，与野生型细胞株、转染空载体的细胞株比较，PCDHl7转染后G1期细胞数増加、S期细胞数明显减少(P < 0. 05)，说明P⑶H17阻止了 HCT116细胞的G1-S期转换，抑制了 HCT116细胞的增殖；但在MKN45细胞中，PCDH17转染后G1期和S期细胞数与其对照组野生型细胞株、转染空载体的细胞株比较无明显统计学意义(P > 0. 05)。实施例8 P⑶H17转染后对肿瘤细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验
取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在10%基础培养基中，计数，以每孔I X IO6个细胞接种在6孔板中。待培养至细胞铺满底面，用无菌枪头在底面沿直径划动，划出两条基本垂直的直线划痕，用PBS洗细胞3次，以去除划下的细胞，加入10%基础培养基2ml，置于37°C、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。每隔12小时取样一次，拍照。实验重复三次。Transwell细胞迁移实验
细胞迁移能力测定采用PET膜8 iim孔径24孔小室系统(美国Corning公司)。取对数、生长期无血清培养48h的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在1%胎牛血清的基础培养基中，计数，调整细胞浓度为IXlO6个/ml，备用。下室加入含2.5%胎牛血清的基础培养基600iil，取IOOiU上述细胞悬液加入上室，放入37°C、5% CO2及饱和湿度的的细胞培养箱中培养。48小时后，甲醇固定10分钟，用0. 25%的结晶紫溶液染色15 20分钟，用棉签轻轻擦去膜上室面尚存留的细胞，然后用手术刀片将膜完整切下。在低倍光镜下计数膜下室面的细胞。实验重复三次。
通过划痕实验我们分析了 PCDH17对肿瘤细胞迁移能力的影响，结果发现在同样培养条件下，野生型细胞株、转染空载体的细胞株和转染PCDH17的细胞株在48小时时同样完全覆盖约2mm宽的划痕，这提示PCDH17对肿瘤细胞的迁移能力可能无明显影响。通过transwell cell migration assay实验进一步研究发现，接种同样细胞个数在transwell膜上方48小时后，转染PCDH17的细胞株穿过膜上方进入膜下方的细胞个数与其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株相比无明显统计学差异，这进一步说明了 PCDH17对肿瘤细胞迁移能力无明显影响。实施例9 P⑶H17转染后对肿瘤细胞自发凋亡的影响 流式流式细胞仪检测细胞凋亡
将原细胞培养液全部转入15ml离心管中(含全部悬浮细胞)，PBS洗涤贴壁细胞一次，用含EDTA的0. 25%的胰蛋白酶消化细胞，达到合适消化状态后，加入上ー步骤中收集的细胞培养液終止消化，将细胞轻轻吹打下来后，一起转到离心管中，IOOOg离心5分钟，去除上清。收集来的细胞用PBS重悬,再次IOOOg离心5分钟,去除上清,用I Xbinding bufferIml重悬细胞，计数，调整细胞数至I X IO6个/ml。取100 ill细胞悬液加入5ml的上样管中，并将细胞凋亡较多的细胞株中剰余的细胞悬液等分到3个校正上样管中(空白，FITC单阳，PI单阳)，每个样本的上样管中均加入5iU FITC-Annexin V和5yl PI ;校正上样管按需要加(空白管不加，FITC单阳加5iUFITC，PI单阳加5 ill PI )，轻弹上样管底部使之混勻，室温下避光孵育15分钟。最后在各个上样管中再各加入IXbinding buffer 400 U I,随即进行流式细胞仪检测。Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。结果显示P⑶H17转染株中凋亡细胞的比例与其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株中凋亡细胞的比例相比较无明显统计学意义，这说明PCDH17转染后并不影响肿瘤细胞的自发凋亡。实施例10-12 P⑶H17与肿瘤细胞对5-FU敏感性的相关性研究 MTT法检测5-FU的细胞毒作用
MTT比色分析法ー种检测细胞活力和生长的方法。主要原理是活的増殖细胞可通过线粒体能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶将MTT (四甲基偶氮唑盐)还原成不溶于水的蓝紫色甲臜产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。ニ甲基亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，在一定细胞数范围内，MTT结晶物的形成量与细胞数目成正比，通过酶标仪测定OD值来反映细胞数目或细胞活力。取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在10%胎牛血清的基础培养液中，计数，以每孔4000个细胞接种到96孔板中，每孔体积IOOii I。培养I天后加入IOOii I含5-FU的培养液(MKN-45 :80 y g/ml ； HCTl 16 :20 y g/ml)，置于细胞培养箱中孵育16小时。孵育16小时后每孔加MTT溶液(5mg/ml的PBS溶液)20 U 1，继续孵育4小吋。4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养液。每孔加DMSO150 yl，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择570nm波长，在酶标仪(美国BIO-TEK公司)上測定各孔吸光度值，记录吸光度值結果。流式流式细胞仪检测细胞凋亡(具体步骤同实施例9)
Western-blot检测P⑶H17对凋亡相关通路的影响(具体步骤同实施例6)
5-FU是胃肠道肿瘤基础的化疗药物之一。抗肿瘤药物的ー个最大缺点是易产生耐药性而使化疗疗效降低。肿瘤细胞耐药表现为原药耐药和多药耐药两种形式前者只对诱导药耐药，对其他药物不生产交叉耐药。这类抗肿瘤药多是抗代谢药，如MTX、5-FU、Ara-c及部分DDP和CTX等；多药耐药(MDR)是指不但对诱导它的药物产生耐药，而且对其他结构不同、作用机制各异的药物也产生交叉耐药。这类药物多数是天然生物碱类和抗生素类，分子量较大，亲脂性高，又称MDR药，如ADM、MTT、VP-16、VM-26、VLB、VCR等。目前的研究也提示 化疗耐药与某些基因的过度表达有夫。为了研究P⑶H17是否会影响5-FU对肿瘤细胞的杀伤效果，我们根据既往HCTl 16和MKN45细胞株的药敏曲线，确定了 16小时的5-Fu半数致死量(IC5tl), HCTl 16细胞IC5tl为20 u g/ml ；MKN45细胞IC5tl为80 u g/ml。按上述浓度的5-FU分别处理野生型细胞株、转染空载体的细胞株和转染PCDH17的细胞株16小时后，通过MTT法检测了各组细胞株的细胞活力，结果显示转染P⑶H17的细胞株的细胞活力明显低于其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株，这说明PCDH17转染后增强了肿瘤细胞对5-FU的敏感性(图3)。进ー步通过荧光显微镜观察，我们发现转染P⑶H17的细胞株在5-FU处理后出现较多的皱缩凋亡细胞，而野生型细胞株和转染空载体的细胞株中的皱缩凋亡细胞数较少，这进一步说明了PCDHl7能够增强肿瘤细胞对5-FU的敏感性。同时通过流式细胞仪我们分析了 PCDH17对肿瘤细胞凋亡的影响。结果显示经5-FU处理后，转染P⑶H17的细胞株中凋亡细胞的比例明显高于其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株，这亦说明P⑶H17转染后促进了肿瘤细胞的凋亡(图4)。最后我们通过Western-blot分析了 P⑶H17对肿瘤细胞凋亡相关通路的影响。结果显示P⑶H17诱导了活化的RARP和caspase-3的表达、促进了促凋亡相关蛋白Bax的表达、抑制了抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，这些结果表明P⑶H17的表达对胃肠道肿瘤细胞的凋亡起到了促进作用。上述实验结果说明P⑶H17增强了 HCT116和MKN45细胞株对化疗药物5_FU的敏感性，明显促进了 5-FU诱导下的细胞凋亡。实施例13-15 P⑶H17转染后对肿瘤细胞自噬的影响 细胞自噬实验
(I) ロ丫唳澄(Acridine Orange, A0)染色
吖啶橙是ー种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA的结合量存在差別，由此可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄緑色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体，吖啶橙使其染上致密浓染的黄緑色荧光，或黄緑色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙也可作为ー种非极性反胶态分子团的分子探针，当酸性磷酸酶活性增强时其在自噬溶酶体内发红色荧光。取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在10%基础培养基中，计数，备用。载玻片用75%的酒精浸后，在酒精灯上过火烘干，放入6孔板内，每孔接种2X IO5个细胞，加入含10%胎牛血清的基础培养基2ml。同时取IXlO6个细胞接种于6cm培养皿中，加入含10%胎牛血清的基础培养基2ml。过夜培养后，PBS洗涤两次，更换无血清培养基饥饿24小吋。然后去除培养液，加入含I U g/ml吖啶橙的PBS溶液2ml，置于37°C、5% CO2孵箱中孵育15分钟。细胞爬片经PBS洗涤、DAPI染色、50%甘油封片后置于荧光显微镜下观察。产 生自噬的细胞其细胞核被染成棕红色。6cm培养皿中细胞经消化后取I X IO5个细胞重悬于含I y g/ml吖啶橙的PBS溶液Iml中，置于37°C、5% CO2孵箱中孵育15分钟。然后流式细胞仪检测自噬细胞所占比例。(2) GFP-LC3B 瞬时转染
自噬小体形成是细胞发生自噬现象的重要特征，自噬小体的检测可以通过分析细胞内源性LC3或合并自噬泡的GFP - LC3B颗粒来证实。取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化井吹打成单个细胞，离心后把细胞悬浮在10%基础培养基中，计数，备用。载玻片用75%的酒精浸泡然后，在酒精灯上过火烘干,放入6孔板内，每孔接种5X105个细胞，加入含10%胎牛血清的基础培养基2ml。过夜培养后，PBS洗涤两次，更换无血清培养基饥饿24小吋。然后去除培养液，按照OriGene公司Mega tranl. 0试剂盒说明书进行GFP - LC3B质粒瞬时转染，瞬转32小时。32小时后去除培养液，用预冷的PBS溶液洗涤两次，再用4%甲醛(pH 7.4)室温固定20分钟。最后细胞爬片经PBS洗涤、DAPI染色、50%甘油封片后置于荧光显微镜下观察。产生自噬的细胞其细胞质内出现点状浓聚的GFP - LC3B颗粒。(3)自噬相关抗体检测
取对数生长期的野生组、空载对照组、P⑶H17转染组细胞提取总蛋白，通过Western-blot检测自卩遼相关抗体BCL-1、Atg_5、Atg-12和LC3B的表达情况。吖啶橙是ー种荧光染料，可作为非极性反胶态分子团的分子探针，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下发红色荧光。荧光显微镜观察显示转染PCDH17的细胞株中着色细胞的比例明显高于其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株，这说明PCDH17转染后促进了肿瘤细胞自噬的发生(图5A)。进ー步我们收获所有细胞(包括悬浮细胞)通过流式细胞仪检测了自噬细胞在各组细胞中所占的比例，结果显示转染PCDH17的细胞株中自噬细胞的比例明显高于其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株，这同样说明PCDH17转染后促进了肿瘤细胞自噬的发生(图5B)。为了进一步验证PCDH17转染后促进了肿瘤细胞自噬的发生，我们将各组细胞去血清饥饿24小时后，瞬时转染GFP-LC3B质粒32小时。当自噬被诱导时，转染GFP-LC3B质粒的细胞其细胞质内会出现点状浓聚的GFP - LC3B颗粒。荧光显微镜观察显示，转染P⑶H17的细胞株中点状浓聚的GFP - LC3B颗粒的比例明显高于其对照组野生型细胞株和转染空载体的细胞株，这更进一步说明P⑶H17转染后促进了肿瘤细胞自噬的发生(图6)。最后我们通过Western-blot分析了 P⑶H17对肿瘤细胞自噬相关通路的影响。结果显示P⑶H17诱导了活化的LC3B II的表达、促进了促自噬相关蛋白Atg-5和Atg-12的表达(图7)。上述实验结果说明P⑶H17增强了饥饿条件下HCTl 16和MKN45细胞株自噬的发生。实施例16 P⑶H17转染对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。
人大肠癌裸鼠皮下种植瘤模型
为了研究PCDH17对胃肠道肿瘤细胞在体内成瘤能力是否存在影响，我们在BALB/c胸腺缺失的裸鼠体内进行了转染KDH17的HCT116细胞(HCT116/P⑶H17)及转染空载体的HCTl 16细胞(HCT116/Vector)的成瘤比较实验。取对数生长期的单层培养的HCT116/PCDH17细胞及HCT116/Vector细胞，用移液器将细胞直接吹下，并吹成单个细胞悬液，收集到离心管中，800g离心5分钟，弃去上清，用无菌的PBS洗涤一次，然后将收集的细胞后用无菌的PBS液重悬，调整细胞浓度为
3.5X106个/0. 1ml，置于碎冰中，在尽可能短的时间内接种。将BALB/C裸鼠随机分为两组，用0号注射器将上述0. Iml细胞悬液接种于裸鼠背部皮下。接种起两天观察一次，重点观察接种点有无感染，区别早期出现的炎症性肿块与肿瘤。从接种后第7天开始记录数据，每两天用游标卡尺记录一次肿瘤的长径及短径，肿瘤体积用下述公式计算体积=(最短径)2x最长径X0. 5。在接种后第21天时将用颈椎脱白法处死。以时间为横坐标，肿瘤体积为纵坐标，作生长曲线。我们建立了转染空载体的HCT116细胞株和转染P⑶H17的HCT116细胞株的裸鼠皮下种植瘤模型，进行了体内成瘤能力的比较研究。结果显示接种HCTl 16/Vector细胞组和接种HCT116/ P⑶H17细胞组的裸鼠均有肿瘤生长。比较两株细胞的肿瘤体积曲线发现，接种HCT116/PCDH17细胞的裸鼠，肿瘤生长速率显著慢于对照组细胞接种第16天是肿瘤体积为HCT116/Vector 细胞组 1134±558mm3，HCTl 16/ PCDH17 细胞组 135± 105mm3 ;细胞接种第18天时的肿瘤体积为HCT116/Vector细胞组1437±698mm3，HCTl 16/ PCDH17细胞组173±85mm3 ;实验终止点(第22天)的肿瘤体积为HCT116/Vector细胞组2080±733mm3，HCTl 16/ PCDHl7细胞组266± 158mm3。实验结果提示P⑶H17明显抑制了体内肿瘤细胞的生长。根据上述实施例6-16结果，P⑶H17能够增强肿瘤细胞对5_FU的敏感性而促进了肿瘤细胞的凋亡并能诱导饥饿条件下肿瘤细胞自噬的产生而起到抑癌基因的作用。
权利要求
1.一种PCDH17基因在制备诊断胃癌和结直肠癌的产品中的应用。
2.如权利要求I所述的一种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的诊断胃癌和结直肠癌的产品包括用RT-PCR或甲基化特异性PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品。
3.如权利要求2所述的一种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的用RT-PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品至少含有一对特异扩增PCDHl7基因的引物。
4.如权利要求2所述的一种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的用甲基化特异性PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品至少含有一对特异扩增PCDH17基因的引物。
5.如权利要求3所述的一种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的用RT-PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品中特异扩增POTH17基因的引物序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示。
6.如权利要求4所述的一种PCDH17基因的应用，其特征在于所述的用甲基化特异性PCR诊断胃癌和结直肠癌的产品中特异扩增KDH17基因的引物如SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6所示。
7.—种PCDH17基因作为胃癌和结直肠癌化学治疗敏感性检测新靶点的应用。
全文摘要
PCDH17基因的应用，属于基因技术领域。一方面该基因可作为胃癌和结直肠癌早期诊断的标志物，有利于胃癌和结直肠癌的早期监测和预防；另一方该基因可作为胃癌和结直肠癌化学治疗敏感性检测的新靶点，有利于指导胃癌和结直肠癌的化学治疗。
文档编号C12Q1/68GK102628080SQ201210094789
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者何超, 胡晓彤, 陶谦, 隋新兵 申请人:浙江大学医学院附属邵逸夫医院