040] 由W上技术方案可知，本发明通过meta分析发现了位于CNTN4基因上的达到全基 因组关联分析显著水准的SNP位点，基于此提供了一种评估阅读能力的检测试剂盒W及检 测方法，实验结果来自于中国人群，具有很强的中国人群适应性，同时检测手段经济便捷， 有利于在人群中大范围推广。
【具体实施方式】
[0041] 本发明提供了 CNTN4基因 SNP位点的应用及其检测引物与试剂盒，本领域技术人员 可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0042] 本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0043] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0044] 实施例1
[0045] 分别取学龄儿童人群样本，共计4338人，分别为3个独立的人群样本，每个人群的 大小分别为1976、1143、1219个个体。
[0046] 参照文献Siok，W.T.，化u，Z.，Jin，Z.，Perf'etti，C.A.&l'an，L.H.A S化UCtural-function曰 I b曰sis for dyslexi曰 in the cortex of Chinese readers.Proc.化11 .Acad. Sci .U. S.A. 105,5561-6(2008)。按照语文成绩，阅读成绩和瑞文 评分对上述样本进行筛选。检测结果表明4338人中，共2123人存在阅读障碍。
[0047] 对上述样本进行rsl2636975位点的检测。
[0048] 本发明的测定方法用于测定来源于人的基因组DNA，临床取材样本来源广泛，如体 液、组织细胞等，通过提取和纯化运些样本均可制备基因组DNA。
[0049] 本发明所用的试剂均为市售产品。其中，均购自天根生化科技。
[0050] 按照产品说明书提供的操作步骤，使用0SR-M102-T1血液基因组DNA提取试剂盒及 其配套的0SE-M48核酸提取仪(天根生化科技)制备人外周血基因组DNA。
[0化1] 本发明采用Sequenom MassARRAY对rs 12636975位点进行检测，步骤为：
[0化2] 1、用SEQ ID NO. 1~2所示的引物扩增目的基因片段。PCR扩增：94°C4min;94°C 20s，56°C30s，72°Clmin，共45个循环;72°C5min;4°C保持。每个反应体积为扣l，包括10X PCRbuffer0.扣l，MgCl2(25mM)0.4i^l，dNTPmix(25mM)0.化l，HotS化rTaq(5UA^l)0.化 1，无酶水1.化1，PCR primer mix化1，化1 DNA样本溶液(浓度为20-50ngAU)。
[0053] 2、在PCR结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline 地osphatase，邮碱性憐酸 酶)处理，W去除体系中游离的dNTPs。配制碱性憐酸酶处理反应液，SAP Mix。每个反应所需 SAP Mix的体积为化1，其中包括1.53山无酶水，0.1化1 SAP Buffer,0.3山SAP Enzyme。反 应条件:37 °C 40min，85 °C 5min，4°C保持，启动PCR仪进行碱性憐酸酶处理。
[0054] 3、用SEQ ID NO.3所示的单碱基延伸引物进行单碱基延伸。将化1单碱基延伸反应 液加入上述每个反应体系中，按照W下PCR反应条件进行反应：1.94°Cfor 80s，II .94°C5s， 111.521：53，1￥.801：53，￥.返回111，4个循环，￥1.返回11，39个循环，￥11.721：3111111，珊.41： 保持。
[0055] 4、树脂纯化，忍片点样，质谱分析，检测结果用TY阳R4.0软件(Sequenom)分型并输 出结果。
[0056]其中引物序列为：
[0060] 检测结果如表1:
[0061] 表1基因型检测结果
[0063] 如表1检测结果经Meta分析，SNP位点rsl2636975达到全基因组关联分析显著水准 (p = 2.31 X 1(T8)。检测结果与现有技术鉴定结果相比，基因型为TT或TC人群较CC型阅读障 碍风险低。与CC型相比，TT型的比值比为0.52,置信区间为0.41~0.66;TC型的比值比为 0.72,置信区间为0.64~0.81;该结果与现有技术的评估结果相符。具体的，基因分布如表 2:
[0064] 表2基因型分布
[0067] 根据本发明的结果，TT和TC型提示阅读障碍的风险与CC型相比分别降低48%和 28%。采用本发明的试剂盒，能够更早的提示儿童的阅读能力，使人们能够尽早的实行有针 对性的教育。
[0068] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. CNTN4基因 SNP位点rs 12636975在制备评估人群阅读障碍风险的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人群阅读障碍风险为中国人的人群阅 读障碍风险。3. -种评估人群阅读障碍风险的方法，其特征在于，根据CNTN4基因 SNP位点 rsl2636975的基因型评估人群阅读障碍风险； CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的基因型为TT或TC人群，较CC基因型人群阅读障碍风险 低。4. 根据权利要求3所述的评估人群阅读障碍风险的方法，其特征在于，所述CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的基因型的检测方法包括： 步骤1:以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物和 SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物； 步骤2:所述扩增产物经纯化后，以SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的单碱基延伸引物进 行延伸，获得延伸产物； 步骤3:所述延伸产物经纯化后，测定CNTN4基因 SNP位点rsl2636975的基因型。5. 根据权利要求3所述的评估阅读能力的方法，其特征在于，步骤2中所述纯化为去除 游离dNTPs，采用虾碱性磷酸酶处理。6. 根据权利要求3所述的评估阅读能力的方法，其特征在于，步骤1中所述扩增的程序 为： 94 °C 4 min; 94 V 2 0 s, 5m 30 s, 1共45个循环 72 °C 1 min：;- 72 °C 5 min; 4t3 保持。7. 根据权利要求3所述的评估阅读能力的方法，其特征在于，步骤2中所述延伸的程序 为： L94°C 30 s; II. 购 5 s; III. 52°C 5 s; iv: mv 5 s; V. 返域III，4个循环; VI. 返回II, 39个循环； ￥11.72^ 3min, m, 4°c 保持。8. 扩增CNTN4基因 SNP位点r si 2636975的扩增引物对及单碱基延伸引物； 所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO: 1~2所示； 所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDN0:3所示。9. 一种评估人群阅读障碍风险的试剂盒，其特征在于，包括扩增CNTN4基因SNP位点 rs 12636975的扩增引物对及单碱基延伸引物； 所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ IDN0:1~2所示； 所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDN0:3所示。10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶、虾碱性磷酸酶、虾碱性磷 酸酶缓冲液和无酶水。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，尤其涉及CNTN4基因SNP位点的应用及其检测引物与试剂盒。本发明通过全基因组关联分析分析发现了位于CNTN4基因上的达到全基因组关联分析显著水准的SNP位点rs12636975，基于此提供了一种评估阅读障碍人群风险的检测试剂盒以及检测方法，实验结果来自于中国人群，具有很强的中国人群适应性，研究样本量为目前最大。同时检测手段经济便捷，有利于在人群中大范围推广。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105603111
【申请号】CN201610188149
【发明人】孙义民, 王斌, 周禹稀
【申请人】博奥颐和健康科学技术（北京）有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月29日