一种鉴别鱼腥草与百部还魂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种鉴别鱼腥草与百部还魂的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 中药鱼腥草为S白草科植物蔑菜化OUttuynia cordata化unb)的新鲜全草或干 燥地上部分。中药百部还魂为同科植物裸葫(Gy皿Otheca chinensis Decne)的全草或叶。 两者功效和主治均不相同，但由于分布相同，常混生，形态相似，因此极易误采误用；鱼腥草 与百部还魂的鉴别可从原植物的形态与显微特征等传统手段进行鉴定。但是对于干燥或经 过加工的样品，传统方法进行准确鉴别具有难度。而利用化学成分的分析进行鉴定，则非常 繁琐复杂，也难判断是否混杂。因此急需鱼腥草与其常见混淆品相关产品的快速鉴定方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴别或辅助鉴别鱼腥草和/或百部还魂的引 物。
[0004] 本发明提供的用于鉴别或辅助鉴别鱼腥草和/或百部还魂的引物为如下1)或2)或 3);
[0005] 1)由引物1、引物2和引物3组成的成套引物：
[0006] 2)由引物1和引物3组成的引物对A;
[0007] 3)由引物2和引物3组成的引物对B;
[000引所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
[0009]所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
[0010] 所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
[0011] 上述引物中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比为1:1:1。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴别或辅助鉴别鱼腥草和/或百部还魂的 PCR试剂。
[0013] 本发明提供的用于鉴别或辅助鉴别鱼腥草和/或百部还魂的PC时式剂为如下（1)或 (2)或(3):
[0014] (1)包括上述成套引物；
[00巧](2)包括上述引物对A;
[0016] (3)包括上述引物对B。
[0017] 上述每种PC时式剂中，所述引物1、所述引物巧日所述引物3在所述PC时式剂中的终浓 度均为aiM。
[001引上述PCR试剂中，所述PCR试剂为如下XI)或X2)或X3):
[0019] 所述XI)由上述引物1(2測)2化、上述引物2(2測)2化、上述引物3(2測)2化、TopTaq DNA聚合酶1U、10 Xbuffer缓冲液2.0化、dNTP 20nmo巧日水(补足20化)组成。
[0020] 所述X2)由上述引物1(2咖)2化、上述引物3(2咖)2化、Tophq DNA聚合酶1U、10X buffer缓冲液2.0化、dNTP 20nmo巧日水(补足20化)组成。
[0021] 所述X3)由上述引物2(2咖)2化、上述引物3(2咖)2化、Tophq DNA聚合酶1U、10X buffer缓冲液2.0化、dNTP 20nmo巧日水(补足20化)组成。
[0022] 本发明的第=个目的是提供一种用于鉴别或辅助鉴别鱼腥草和/或百部还魂的试 剂盒。
[0023] 本发明提供的用于鉴别或辅助鉴别鱼腥草和/或百部还魂的试剂盒包括上述引物 或上述PCR试剂。
[0024] 本发明的第四个目的是提供上述引物或上述PC时式剂或上述试剂盒的新用途。
[0025] 本发明提供了上述引物或上述PC时式剂或上述试剂盒在如下(A1)-(A4)中任一种 中的应用：
[0026] (Al)鉴别或辅助鉴别鱼腥草和百部还魂；
[0027] (A2)检测或辅助检测待测样品是鱼腥草还是百部还魂还是鱼腥草和百步还魂的 混合样品；
[0028] (A3)检测或辅助检测待测样品是否为鱼腥草；
[0029] (A4)检测或辅助检测待测样品是否为百步还魂。
[0030] 本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是鱼腥草还是百部还 魂还是鱼腥草和百步还魂的混合样品的方法。
[0031] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品是鱼腥草还是百部还魂还是鱼腥草和百 步还魂的混合样品的方法包括如下步骤：
[00创 （BI)用上述成套引物对待测样品进行PCR扩增，得至化CR扩增产物；
[0033] (B2)检测所述PCR扩增产物的大小；
[0034] 若所述PCR扩增产物含有大小为18化P的片段且不含有大小为389bp的片段，则待 测样品为或候选为鱼腥草；
[0035] 若所述PCR扩增产物含有大小为389bp的片段且不含有大小为18化P的片段，则待 测样品为或候选为百步还魂；
[0036] 若所述PCR扩增产物含有大小为18化P和389bp的片段，则待测样品为或候选为鱼 腥草和百步还魂的混合样品。
[0037] 上述方法中，
[003引所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA;
[0039] 所述PCR扩增的退火溫度为50-58°C。
[0040] 本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否为鱼腥草的方法。
[0041] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否为鱼腥草的方法包括如下步骤：
[00创 （Cl)用上述引物对A对待测样品进行PCR扩增，得至化CR扩增产物；
[0043] (C2)向所述PCR扩增产物中加入SYBR Green I染料，并检测是否发出巧光；
[0044] 若检测到发出巧光，则待测样品为或候选为鱼腥草；
[0045] 若未检测到巧光，则待测样品不为或候选不为鱼腥草。
[0046] 本发明的第屯个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否为百步还魂的方 法。
[0047] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否为百步还魂的方法包括如下步骤：
[004引（Dl)用上述引物对B对待测样品进行PCR扩增，得至化CR扩增产物；
[0049] (D2)向所述PCR扩增产物中加入SYBR Green I染料，并检测是否发出巧光；
[0050] 若检测到发出巧光，则待测样品为或候选为百步还魂；
[0051] 若未检测到巧光，则待测样品不为或候选不为百步还魂。
[0052] 本发明建立的多重PCR方法通过单次PCR即可鉴别鱼腥草与百部还魂是否相互混 杂，为今后有关鱼腥草与百部还魂的相互鉴别提供思路，在防止药材的混用误用中具有实 际应用价值。
【附图说明】
[0053] 图1为鱼腥草与百部还魂鉴别方法示意图。
[0054] 图2为特异性PCR鉴别鱼腥草与百部还魂凝胶电泳。其中，1-8:来源不同产地的鱼 腥草样品，9-16:不同产地百部还魂样品。
[0055] 图3为特异性PCR鉴别鱼腥草与百部还魂凝胶电泳。其中，1-8:来源不同产地的百 部还魂品，9-16:不同产地鱼腥草样样品。
[0056] 图4为多重PCR鉴别鱼腥草与百部还魂凝胶电泳。其中，1-8:来源不同产地的鱼腥 草样品，9-15:不同产地百部还魂样品，16:鱼腥草与百部还魂混合样品。
【具体实施方式】
[0057] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059] 实施例1、鉴别鱼腥草与百部还魂的多重PCR引物的设计
[0060] 1、基因组DNA的提取
[0061 ] 采用碱裂解法分别提取鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb)与百部还魂 (Gymnotheca chinensis Decne)的基因组DNA。上述碱裂解法提取基因组DNA的具体步骤如 下：
[0062] 1)取1〇-25111旨干燥材料(鱼腥草或百步还魂），粉碎后，加入2.〇1111离屯、管中。
[0063] 2)加入200化溶液碱裂解提取液(化OH 0.5M、PVP 1%和IYitonXlOO 1%)，充分 满旋震荡混匀。
[0064] 3)加入800化中和溶液(Tris-HCl 0.1M，抑= 8.0)，充分震荡混匀，12000巧m离屯、 Imin，弃沉淀，取上清液。
[00化]4)取50化L上清液至一新的2.Oml离屯、管内，加入50化L溶液中和溶液（Tris-HCl 0.1M，抑=8.0)，充分颠倒混匀，12000巧m离屯、Imin,取上清。
[0066] 2、PCR 扩增
[0067] 分别W步骤1获得的基因组DNA为模板，采用通用引物matkF与matkR进行PCR扩 [006引增，得到PCR产物，即为matK基因序列。引物序列如下：
[0069] matkF：CGATCTATTCATTCAATATTTC；
[0070] matkR：TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT 〇
[0071] PCR反应体系：总体积20化，其中包括Taq酶IU，10 X buffer缓冲液2.0化，dNTP 20nmol，2iiM引物各化L，灭菌蒸馈水补足20化。PCR反应程序:94°C预变性3min后，94°C变性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，30 个循环后 72°C 延伸 7min。
[0072] PCR产物通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳，用Goldview染色观察并对其进行测序。
[0073] 3、多重PCR引物的设计
[0074] 用Clus化IX 2.1软件对所有鱼腥草与百部还魂样品的大小为936bp的matK序列进 行多重比对，筛选获得鱼腥草和百部还魂的特异位点，发现在该936bp的序列区中，位于该 序列第654~678位点间有多个SNP位点，第371~372位点间有2个SNP位点。
[0075] 根据第654~678位点间的SNP位点设计鱼腥草的鉴别引物化F;根据第371~372位 点间有2个SNP位点设计百部还魂特异位的鉴别引物GcF，同时设计特异引物化F和GcF的共 同反向引物化R。其中，引物对化F和化R是扩增鱼腥草的特异性引物，引物对GcF和化R是扩 增百部还魂的特异性引物。引物序列如下：
[0079] 实施例2、鉴别鱼腥草与百部还魂的方法
[0080] 1、特异性PCR鉴别鱼腥草与百部还魂样品
[0081 ] (1)基因组DNA的提取
[0082] 采用碱裂解法分别提取表1中的鱼腥草化OUttuynia cordata化unb)与百部还魂 (Gymnotheca chinensis Decne)的基因组DNA。
[0083] 表1、实验材料的信息
[0085] (2)PCR 扩增
[0086] 分别W步骤（I)的基因组DNA为模板，采用引物HcF和H排进行PCR扩增，得到PCR产 物。
[0087] PCR反应体系：总体积20化，其中包括TopTaq DNA聚合酶(QIAGEN，200201) IlMOX buffer缓冲液2.0化、dNTP 20nmol、引物化CF和HgR)各化L，灭菌蒸馈水补足20化。
[008引 PCR反应程序:94°C预变性3min后，94°C变性30s，50 °C退火30s，72 °C延伸Imin，30 个循环后72°C延伸7min。
[0089] (3)电泳
[0090] PCR产