1
[0046]
[0047] 根据上述条件PCR的结果，去扩大样本量扩增，PCR扩增反应体系为：5XPrimer STARBuffer(Mg^^plus) 5yL,dNTPsmixture(2. 5mmol?Li) 3y1^,引物（10ymol?Li)各 1yLPrimeSTAR服DMPolymerase灯akara，2.抓?yL1) 0. 25yLDNA40ng，灭菌蒸馈水 补足至25yL。选择西洋参8个样本去扩增验证，结果稳定性不强，不能稳定的扩增。
[004引对两对引物进行不同深度梯度的摸索。
[0049]引物对 2 为（10ymol?L1)各 1yL不变，引物对 1 为（2ymol?L1)各 1yL; (2ymol?L1)各 2yL; (1ymol?L1)各 1yL; (1ymol?L1)各 2yL; (0. 715ymol?L1) 各 1yL; (0. 715ymol?L1)各 2yL; (0. 5ymol?L1)各 1yL; (0. 5ymol?L1)各 2yL。
[0050] 根据上述体系条件下PCR的结果，去扩大样本量扩增，扩增结果全无条带。
[0051] 经过多次的摸索和验证，最终确定能稳定PCR扩增的反应体系如下：5XP;rimer STARBuffer(Mg2+plus) 5. 0yL，dNTPsmixUire(2. 5mM) 3yL，鉴别引物对 1 (2yM) 2yL，弓I 物对2(2. 5yM)lyLPrimeSTAR服DMPolymerase灯akara，2. 5U/yL)0. 25yLDNA模板 1.0^以无菌双蒸水补充体系至25yL。所述PCR扩增反应的参数如下：95°C预变性3min， 98°C变性 10s，50°C退火 15s，72°C延伸Imin，30 个循环后，72°C延伸 7min。
[0052] 本发明通过设计两组PCR引物，利用多重PCR扩增的方法，对待测样品通过一次常 规的PCR扩增，仅通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示即可判定出该待测样本是否为西洋 参。总之，本发明通过特异性多重PCR的方法实现了西洋参的快速、准确鉴别。
【附图说明】
[0053] 图1:多重引物对扩增西洋参药材的电泳图，样本XI~X15,西洋参阳性对照样本 编号XI(标为"M")，人参样本编号R1对照，S屯样本编号S1对照；
[0054] 图2:多重引物对扩增人参药材的电泳图，人参样本R1~R50,空白对照（标为 "_，，）；
[005引图3 :多重引物对扩增立屯药材的电泳图，人参样本编号R1对照，西洋参阳性对照 样本编号Xl(标为叩"），S屯样本S1~S19,空白对照（标为"M");
[0056] 图4:多重引物对扩增易混品药材的电泳图，西洋参阳性对照样本编号XI(标为 "P")，人参样本编号R1对照，S屯样本编号S1对照，易混品样本H1~H10,空白对照（标 为;
[0057]图5:多重引物对扩增其它中药材的电泳图，西洋参阳性对照样本编号Xl(标为 "P")，人参样本编号R1对照，S屯样本编号S1对照，中药材样本Z1~巧8,空白对照（标 为;
[0058]M:为DNA分子大小标记（Marker)，DNAladder巧Obp)从上至下依次为：500bp、 400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp;
[0059] 图6:采用通用引物口S2对所有样本扩增的结果，样本编号和上述图1至图5 相同。M:为DNA分子大小标记（Marker)D2000,从上至下依次为：2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp。空白对照（标为
[0060] 具体实验方式
[0061] 1.材料
[0062] 从不同产地和市场收集不同的品种材料，本发明所设及材料样本总计：152批，其 中：西洋参15批；人参药材50批（说明R1~R31是人参，R32~贴0是经糖炮制过的人 参，为习称的红参或白参）；S屯19批；混伪品10批；其它中药材58批。（材料如表1至 表5所不）。
[0063] 2.基因组DNA提取：用70%乙醇对样本表面擦试消毒，洁净通风处挥干，使用研磨 罐进行样本粉碎，各样本称取粉末30mg置于离屯、管中，采用原平瞧生物技术有限公司的新 型广谱植物组DNA快速提取试剂盒法提取各材料的总DNA，4°C保存备用。
[0064] 3.PCR扩增，PCR反应在200yLPCR反应管中进行，反应体系总体积25yL其中 包括：：SXPrimerSTARBuffe;r(Mg2+plus)5.OuLdNTPsmix1:ure(2. 5mM)3]iL鉴别引 物对 1 (2yM) 2yL引物对 2 (2. 5yM) 1yLPrimeSTAR服DMPolymerase灯akara，2.抓/ yL) 0.25化，DM模板1.0化，无菌双蒸水补充体系至25化。PCR反应液配制完成后，轻 拔反应管底部混匀再离屯、10s，将PCR管放入PCR仪中，PCR反应参数：95°C预变性3min， 98°C变性10s，50°C退火15s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C延伸7min，4°C保存。
[0065] PCR鉴别极易出现假阳性和假阴性结果，为防止误差的产生，PCR鉴别须建立严格 的阳性、阴性及空白对照。阳性对照为中国食品药品检定研究院的西洋参标准药材对照品， 阴性对照为西洋参的易混品，空白对照为灭菌双蒸水代替模板DNA。同时，为了确保特异性 PCR的扩增率，采用通用引物口S2对所有用于PCR鉴别的样本DNA进行扩增，W验证模板 DNA的可靠性。
[006引 ITS2引物序列：
[0067] 口S2F:5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'(沈QIDNO. 5)
[0068]ITS3R:5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3,（沈QIDNO. 6)
[006引ITS2通用引物扩增条件，在200uL离屯、管中进行，反应总体积为25uL，反应体系包 括 10XPCR缓冲液 2.加L，dNTPs(2. 5mmol?L1)化L，hqDNA聚合酶化抓?L1)0.加L，模 板1祉，无菌双蒸水补充体系至25yL。PCR反应参数：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C 退火303,72°(：延伸453,40个循环后，72°(：延伸10111111，4°(：保存。
[0070] 4.反应结束后，取5yL扩增产物加1yL6XLoadingBuffer混匀，采用2 %的琼 脂糖凝胶，在lOOV电压下电泳40分钟，在凝胶成像系统下观察并拍照保存。
[0071] 电泳结果如图1、图2、图3、图4、图5,结果可见，西洋参能够扩增出片段大小约为 400bp和150bp大小的两条特异带型，而人参，=屯等其它药材样本均无此特异带型，表明 该体系能够将西洋参准确的鉴别出来。
[0072] 本发明所有样品信息如表2至表6所示：
[0073] 表2西洋参样本
[0074]
[00巧]
Luu/y」
[0〇8引表5混伪品样本
【主权项】
1. 用于鉴别西洋参的多重PCR特异引物对，其特征在于，所述多重PCR引物对包括引物 对1和引物对2 ;所述引物对1的序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示；所述引物对2 的序列如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。2. -种利用多重PCR鉴定西洋参的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 采用权利要求1所述的多重PCR引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增反应，获得 扩增产物； (2) 电泳所述扩增产物，若电泳后存在400bp、150bp的两条特异带型，则确定待测样品 为西洋参。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑴所述PCR扩增的反应体系如 下：5XPrimerSTARBuffer(Mg2+plus)5.0iiL，dNTPsmixture(2.5mM)3iiL，鉴别引物 对 1(2yM) 2yL，引物对 2(2.5yM)IyL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara，2. 5U/ yL) 0. 25yL，DNA模板I. 0yL，无菌双蒸水补充反应体系至25yL;所述PCR扩增反应的参 数如下：95°(：预变性31^11，98°(：变性1〇8,50°(：退火158,72°(：延伸1111111，30个循环后，72 1€ 延伸7min。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴别西洋参的多重PCR特异引物对及方法，所述多重PCR引物对包括引物对1和引物对2；所述引物对1的序列如SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示；所述引物对2的序列如SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示。对待测样本的总DNA进行PCR扩增，将扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳检测，若可获得约为400bp、150bp的两条特异带型，即可判断所述待测样品为来自西洋参的样品。使用此方法鉴别西洋参的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于西洋参药材的快速鉴定。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105200126
【申请号】CN201510546491
【发明人】李文莉, 肖炳燚, 刘丽, 罗晖明, 聂平, 丁野, 舒毕琼, 孙辉
【申请人】湖南省食品药品检验研究院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年8月31日