(DE3)中，细菌进行培养，待0D600达到0. 6~1. 0时，加入 0. 1~ImMIPTG(异丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷）进行诱导表达，细菌用溶液（含25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8. 0)重悬，通过超声波进行破碎，随后表达的蛋白通过Ni亲和层 析进行纯化，最终用300mM~500mM咪挫进行洗脱，透析去除咪挫，加入SUMO Ulpl进行酶 切，目的蛋白和酶的质量比为200:1，置于30°C中酶切2hours或4°C酶切过夜，酶切后的蛋 白溶液再次过Ni柱以除去SUMO标签、SUMO蛋白酶以及未被酶切的SUMO融合蛋白，由此即 可得到全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物。
[0079] 对于C端荧光标记，通常使用pTXBl载体，目的蛋白直接与载体所带的内含肽标 签（intein)融合。构建好的表达载体被转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，细菌进行培养， 待0D600达到0. 6~1. 0时，加入0. 1~ImM IPTG进行诱导表达，细菌用缓冲液（含25mM Tris-HCl、150mMNaCl、pH8. 0)重悬，通过超声波进行破碎，随后表达的蛋白通过chitin亲 和层析进行纯化，此时纯化的蛋白会滞留在chitin柱上，用含50mM MESNA(2-疏基乙基磺 酸钠）的缓冲液（该缓冲液中含25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8.0)快速冲洗树脂，然后将 层析柱置于室温诱导自切过夜，从而使融合标签和目的蛋白分离，并且在目的蛋白的C端 形成硫酯键，收集层析柱上的溶液，即可得到全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物。
[0080] (二）步骤 2 :用缓冲液（含 25mM Tris-HCl，150mM NaCl、pH 8. 5)将的到的全长 蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物的浓度调整至10uM左右，然后加入终浓度为50mM 的MESNA、0. 5~ImM的荧光标记的多肽，室温反应过夜。
[0081] 对于N端拼接，加入的焚光多肽的N端为焚光基团，C端为硫醋键。
[0082] 对于C端拼接，加入的焚光多肽的N端为半胱氨酸，C端为焚光基团。
[0083] 拼接完成后用分子筛层析去除未标记的荧光多肽，流动相的溶液组分为25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8.0,荧光标记的目的蛋白先流出，荧光后流出，由于目的蛋白和 荧光多肽的分子量差别很大，因此两者可以得到充分的分离。由此即可得到荧光标记的全 长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物。
[0084](三）步骤3 :分离得到的荧光标记的全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物 与目的蛋白酶相互作用。
[0085] 不同蛋白酶的的反应条件不同，通常采用目的蛋白酶最适的反应温度和pH如下： 温度一般在20~37°C，pH2. 0~9. 0。
[0086] 荧光标记的全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物的反应浓度一般采用 luM，蛋白酶浓度在InM~100nM之间进行调整，选取最适的反应浓度。反应条件确定后，蛋 白酶和蛋白底物混合在一起，蛋白酶识别蛋白底物上的位点，就会释放带有荧光基团的多 肽。当抑制剂与蛋白酶或蛋白底物结合后就会阻碍蛋白酶与蛋白底物的相互作用，带有荧 光基团的多肽就不会释放，通过检测荧光信号的变化就可实时反应这一相互作用。综上所 述荧光标记的全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物即可用于研宄酶与底物的相互 作用或用于药物筛选。
[0087](四）步骤4 :酶与荧光标记的全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物相互作 用会产生带有荧光基团的多肽，这时会导致荧光信号的变化。当单独使用荧光染料时，一般 采用荧光各向异性来反映，由于荧光标记的全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物比 酶切产生的荧光多肽分子量大很多，两者荧光偏振数值差别很大，因此随着酶切进行荧光 偏振的数值持续下降，从而可实时检测酶切过程，如图3、6、8、11、13。
[0088] 在抑制剂存在条件下，抑制剂与蛋白酶或蛋白底物相互结合阻碍了蛋白酶与蛋白 底物的相互作用，从而导致荧光偏振数值不下降或下降幅度少于无抑制剂存在的情况，从 而可以筛选到可明显抑制蛋白酶和蛋白底物相互作用的抑制剂。当使用荧光染料及其淬 灭剂时，其作用原理和多肽底物相同（如图1所示），在酶切位点的两侧或者蛋白的N端和 C端分别标记上荧光基团和淬灭基团，这时由于荧光基团和淬灭基团距离很近，荧光基团产 生的荧光会被淬灭基团吸收，导致荧光强度大的数值维持在较低的水平，当蛋白底物与蛋 白酶相互作用后，荧光基团和淬灭基团就会分离，荧光不再受荧光淬灭基团的影响，荧光强 度持续上升，从而可以实时检测酶切过程。
[0089] 在抑制剂存在条件下，抑制剂与蛋白酶或蛋白底物相互结合阻碍了蛋白酶与蛋白 底物的相互作用，从而导致荧光强度的数值不上升或上升幅度少于无抑制剂存在的情况， 从而可以筛选到可明显抑制蛋白酶和蛋白底物相互作用的抑制剂。
[0090] 根据本发明的方案，下面列举了几个范例。但是应该清楚的是，根据本发明所描述 的概念想法不仅局限于这几个范例。例如，e-secretase(BACE)的底物APP可以进行全长 蛋白的拼接。对于APP和BACE，均构建了质粒，BACE可在E. coli中表达，全长APP也以可 成功表达。
[0091] 另外，以下涉及的试剂如未特别说明，则为商业化产品。
[0092] 实施例1
[0093] Renin 是酶切 Angiotensinogen 产生 Angiotensinogen I 多肽的蛋白酶。 Renin-Angiotensinogen系统在调节血压上具有重要的作用。从UniProtKB获取 Angiotensinogen的氨基酸序列，为了产生N端焚光标记的Angiotensinogen，一个半胱 氨酸被加到Agiotensinogen的N端，如图5A所示。将氨基酸序列按常规方法进行序 列优化后并合成，通过Bsa I和Xba I将基因克隆至pE-SUMO载体中，并转化至大肠杆 菌BL21(DE3)中。这一蛋白与SUMO蛋白进行融合表达，融合蛋白N端带有6XHis标 签。细菌进行培养，待0D600达到1. 0时，加入0. 5mMIPTG进行诱导表达，细菌用25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8. 0重悬，通过超声波进行破碎，随后表达的蛋白通过Ni亲和 层析进行纯化，最终用500mM咪挫进行洗脱，透析去除咪挫，加入SUMO Ulpl进行酶切， SUMO-Angiotensinogen和SUMO蛋白酶的终浓度分别为2mg/ml和0. 01mg/ml。酶切后的 产物再次过Ni柱来分离SUMO蛋白和Angiotensinogen。为将荧光染料和纯化蛋白的N 端连接在一起，Angiotensinogen (0? 5mg/ml)和终浓度 ImM 的 FITC-AlaAla-thioester 在 50mM MESNA存在下反应过夜。反应体系为25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 8. 5。反应完 成后过量的FITC-AlaAla-thioester通过分子筛去除，分子筛流动相的溶液组份为25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8. 0,收集最先流出的带有荧光染料的组分，即为最终的产物 FITC-Angiotensinogen。在 FITC 和 Angiotensinogen 之间有"AAC"三个氨基酸，如图 5 所 不〇
[0094] Renin 酶切 FITC-Angiotensinogen 会产生两种产物：FITC-AAGCDRVYIHPFHK (FITC-angiotensin)和 Angiotensinogen 蛋白。将 250ng Renin (终浓度 62. 5nM)加 入到 100 y 1 FITC-Angiotensinogen (50mM PB，pH6. 5)中在 37 °C 中开始酶切反应。 FITC-Angiotensinogen的终浓度为1 y M。由于FITC-angiotensin的分子量远小于 FITC-Angiotensinogen，当Renin酶切产生FITC-angiotensin后焚光偏振就会降低，如图6 曲线A所示。当在酶切体系中加入终浓度为10 y M的特异性Renin抑制剂（RRPFH-Sta-IHK) 后，荧光偏振变化很小，如图6曲线B所示。这一结果证实Renin可以特异性的酶切 FITC-Angiotensinogen，可用作Renin活性测定的底物，并可用于鉴定Renin的抑制剂。
[0095] 另外一个标记全长Angiotensinogen的策略是删除Angiotensinogen N端的16 个氨基酸。截短的Angiotensinogen的N端有一个Cys，蛋白与SUMO融合表达，氨基酸序列 如图7A所示。将所需基因用PCR按常规方法扩增出来，通过Bsa I和Xba I将基因克隆至 pE-SUMO载体中，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。这一蛋白与SUMO蛋白进行融合表达，融 合蛋白N端带有6XHis标签。细菌进行培养，待0D600达到1.0时，加入0. 5mMIPTG进行 诱导表达，细菌用25mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8. 0重悬，通过超声波进行破碎，随后表达 的蛋白通过Ni亲和层析进行纯化，最终用500mM咪唑进行洗脱，透析去除咪唑，加入SUMO Ulpl进行酶切，即可得到N端缺失16个氨基酸的Angiotensinogen。将N端缺失16个氨 基酸的 Angiotensinogen (0.5mg/ml)与 ImM 多肽（5-TAMRA)-DRVYIHPFHLVIHNEST-thioest er在50mM MESNA存在下反应过夜就会产生形式稍微不同的（5-TAMRA)-Angiotensinogen， 如图7所示，反应体系为25mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH