> 涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂
二、试剂:
四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司其他试剂均为分析纯试剂
三、步骤
1.单克隆抗体的制备
(1)实验动物:选5只8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；
(2)抗原配置:将单增李斯特菌P60蛋白用生理盐水稀释，涡旋混合均匀；
(3)乳化:将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；
免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫;冲免3天后眼眶采血后进行融合；
(4)采血:第三次免疫后I周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；
(5)融合、筛选:采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；
(6)抗体的纯化和保存:采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入_20°C保存。
[0018]2、ELI SA 反应过程:
抗体效价测定步骤:
(1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100yL/孔，于4°C冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 yL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；
(2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200yL/孔，于37°C温育箱内温育2 h后取出烘干待用；
(3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100yL/孔，37°C孵育I h后洗涤、拍干；
(4)每孔加入100口1^、1:3000稀释的!^标记的羊抗鼠186，37°(3孵育1 h后洗涤、拍干；
(5)每孔加入100yL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37°C反应15 min，取出后每孔加入100 yL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。
[0019]李斯特菌属双抗体夹心ELISA法测定步骤: A包被:用4yg/mL的2G7包被酶标板，10yL /孔，4°C过夜；
B洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200yL/孔，然后甩干反应板；
C封闭:含0.2%明胶的083，20(^ /孔，37°C封闭2h;
D洗涤:同B;
E 样品:用I3BST将李斯特菌属稀释成108、3.3 X 107、I.I X 107、3.7 X 106、I.23 X 106、4.12 X 15、1.37 X 15、4.57 X 14 CFU /mL系列浓度，另设4个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37°C温育Ih;
F、洗涤:同B;
G、加酶标抗体(2H8-HRP，2yg/mL)，10yL/孔，37°C反应Ih ；
H、洗涤:同B;
1、显色:加底物TMB100 yL /孔，显色1min;
J、终止:加终止液50yL /孔；
K、测定:用酶标仪检测OD45onm
3、交叉率的测定
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌精确稀释成18 CFU/mLUO7 CFU/mL并在建立的单增李斯特菌双抗体夹心ELISA法体系中检测吸光值，并设空白孔和单增李斯特菌阳性对照，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。
[0020]试验结果如下:
1、标准曲线:本方法对李斯特菌检测范围在1.37 X 15—3.3 X 17 CFU/mL，对单增李斯特菌ATCC19118(4e)检测范围在1.26X106—18 CFU/mL，对P60蛋白的检测范围在0.13-
11.1ng/mL，具体请见说明书附图。
[0021]2、实际检测限:空白的平均吸收值的2.1倍的吸收值对应的菌体浓度。对单增李斯特菌ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC54003^CMCC 54004^CMCC 54007、冻牛肉分离株以及李斯特菌属的ATCC 19119(Listeriaivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897 (Listeria welshimeri,6b)、ATCC 25400(Listeria grayi)的实际检测限(P/N 2 2.I)分别为I.36 X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.22X 106CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36X15CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、4.53 X 104CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、l.36Χ105CFU/mL、1.36 X 105CFU/mL。同时对P60蛋白的实际检测限达为0.137 ng/mL，线性范围为0.13-11.1ng/mL。
[0022]3、交叉反应率(CR%)
结果:李斯特菌正常显色，而18 CFU/mL以及以下浓度的其它测试菌株均不显色(0D〈0.15)。说明建立的李斯特菌属夹心法与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌无交叉反应，特异性良好。
【主权项】
1.一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，其特征在于酶标板上包被了包被抗体2G7，可特异性捕获李斯特菌属内的李斯特菌，2H8-HRP为酶标抗体，包被抗体2G7与李斯特菌结合后催化底物在450nm产生吸收值，P/N 2 2.1时被判定为阳性，反之，P/N< 2.1则判定为阴性； 抗体2G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCCN0.10875； 酶标抗体2H8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC N0.10876； 步骤为: (1)李斯特菌属单克隆抗体的制备 以原核表达的单增李斯特菌P60蛋白为免疫原，免疫8周龄BALB/c小鼠，经常规免疫、融合后用单增李斯特菌CMCC 54003菌体包被检测阳性，得到的阳性孔用ATCC 19111、ATCC.19115、ATCC 19118、CMCC 54002^CMCC 54004^CMCC 54007、冻牛肉分离株以及李斯特菌属的ATCC 19119,ATCC 33090,ATCC 35897,ATCC 25400包被的板检测细胞株的交叉反应，挑选对李斯特菌属均有交叉反应的强阳性孔进行亚克隆；随后3次亚克隆后第7天均采用同样的方案检测阳性孔的交叉反应并选孔进行亚克隆；多重筛选得到15株李斯特菌属特异性单克隆抗体，分别标记辣根过氧化物酶HRP，并以单增李斯特菌CMCC54003为目标物进行两两配对； 配对参数如下:包被抗体2G7 4yg/mL;包被液为pH 9.6、0.0lM的碳酸盐缓冲液;标品CMCC 54003浓度5X10~7CFU/mL;标品稀释液含0.1% Tween 20的pH 7.2、0.0lM的PBS;酶标抗体2H8-HRP稀释1000倍使用，在此条件下，实验成功得到了 18对P/N>5的配对； (2 )李斯特菌属特异性ELI SA方法的建立 配对后，比较不同配对的检测限和交叉反应;在此基础上，用包被抗体2G7和酶标抗体.2H8-HRP建立了李斯特菌属特异性的夹心ELISA分析方法； 具体参数如下: 包被抗体2G7包被浓度:4yg/mL， 包被液:pH 9.6、0.0IM碳酸盐缓冲液， 标品稀释液:含0.1% Tween 20的pH 7.2、0.0lM的PBS溶液， 酶标抗体2H8-HRP浓度:2yg/mL， 反应时间:包被、封闭:37°C，2h ；标准品:37°C，Ih ；酶标抗体37°C，Ih ；显色1min ； 本方法对包括单增李斯特菌在内的李斯特菌属的快速，高灵敏检测；对单增李斯特菌ATCC 1911UATCC 19115、ATCC 19118、CMCC 54002、CMCC 54003、CMCC 54004、CMCC.54007、冻牛肉分离株以及李斯特菌属的ATCC 19119、ATCC 33090^ATCC 35897^ATCC 25400的实际检测限 P/N > 2.I 分别为 I.36 X I O5CFlVmL、1.36 X 105CFU/mL、I.22 X 106CFU/mL、I.36X105CFU/mL、1.36 X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36 X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、.4.53 X 104CFU/mL、I.36 X 105CFU/mL、I.36 X 105CFU/mL、I.36 X 105CFU/mL;同时对P60蛋白的实际检测限达到了0.137 ng/mL，线性范围为0.13-ll.lng/mL;对测试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌没有交叉反应。
【专利摘要】一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，属于免疫分析技术领域。本发明用原核表达的单增李斯特菌P60蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠，经免疫、融合、多重筛选得到15株李斯特菌属特异性单克隆抗体，分别标记辣根过氧化物酶HRP，并以单增李斯特菌CMCC54003为目标物进行两两配对。经筛选不同配对的交叉反应，以2G7为包被抗体、2H8-HRP为酶标抗体建立夹心ELISA方法对包括单增李斯特菌在内的李斯特菌属均有交叉反应。对测试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌没有交叉反应。本发明制备了李斯特菌属特异性的单克隆抗体并建立了双抗体夹心ELISA法，为食品中李斯特菌属的特异性快速检测提供了技术手段。CGMCC No.1087520150519
【IPC分类】G01N33/535, G01N33/569, G01N33/543, C07K16/12, G01N33/577
【公开号】CN105527441
【申请号】CN201610039900
【发明人】匡华, 王文彬, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 吴晓玲, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月21日