一种用于二乙酰精胺(das)检测的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及检测二乙酷精胺(NI ,Ni2-Diacetylspermine,简称DAS)含量的方法，具 体的说是一种用于二乙酷精胺(DAS)检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 大肠癌包括结肠癌和直肠癌，大肠癌在全世界的发病率在恶性肿瘤中排在第= 位，在我国的发病率排在第五位，我国男性的肠癌发病率是十万分之十六，女性为十万分之 十四，是最常见的肿瘤之一。西方人主要是W结肠为主，70%到80%患者所患为结肠癌，直 肠癌患者占20%到30%。我国却相反，直肠癌患者占60%到70%，结肠癌占30%到40%。近 年的研究分析发现，我国的直肠癌发病率基本保持不变，结肠癌发病比例却在上升。尽管化 疗对转移性结肠癌患者有效，但预后较差。因此，研究制备用于检测结肠癌患者肿瘤标志物 含量的试剂盒具有重要的社会意义和科学价值。
[0003] 多胺包括腐胺、尸胺、亚精胺和精胺，是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化 合物的总称。可看作是氨分子中1-3个氨原子被烷基或芳基取代后而生成的物质。可W由原 核和真核细胞产生。快速生长的组织通常有活跃的多胺合成系统，含有大量的多胺。当体内 存在运样的组织时，尿液中多胺的合成会增加。先前的研究表明与健康人相比，癌症患者尿 液中多胺的含量增加。然而，后续的研究显示尿液中总的及游离的多胺含量由于产生了大 量的假阳性和阴性结果，因而不能作为可靠的肿瘤标志物。
[0004] DAS分子式为Cl边3〇N4〇2,分子量286.41，是一种多胺的二乙酷基衍生物，在体内由 鸟氨酸经鸟氨酸脱簇酶作用生成。二乙酷精胺是肿瘤细胞的代谢产物，排泄到尿中。细胞癌 变后，乙酷基多胺分泌增加，导致肿瘤患者尿液中二乙酷精胺浓度明显升高。DAS的早期检 测是通过高效液相色谱法化化C)完成的，后来建立了适用于尿液中DAS含量检测的酶联免 疫吸附系统。有研究显示，尿液中DAS表达量的检测可W作为结肠癌、乳腺癌和肝癌有效的 新型肿瘤标志物。至此，用于尿液中DAS含量检测的化ISA检测方法得到了广泛的临床研究。 但化ISA检测方法同样存在操作复杂，不能批量检测等问题。本发明开发的利用全自动生化 分析仪检测患者样本中DAS含量的比浊法检测试剂盒，是一种比ELISA检测方法更为方便、 快捷的检测技术，能够一次对大量样本进行检测，并且其灵敏度高，操作简单。
【发明内容】
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[000引本发明目的在于提供一种二乙酷精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种二乙酷精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，包括Rl试剂，R2试剂，标准品 和质控品，所述Rl试剂为将二乙酷精胺抗体偶联在纳米颗粒上，添加保护液后W液体形态 或者冻干后的固定形态保存的试剂;所述的R2试剂为将乙酷精胺(DAS)分子通过偶联试剂 偶联在载体蛋白上，W液体形态或者冻干后的固体形态保存的试剂。
[0008] 所述二乙酷精胺抗体是W乙酷精胺化AS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上所 得的产物作为免疫原，再免疫动物获得多克隆抗体或经筛选获得单克隆抗体。
[0009] 所述Rl中保护液按重量百分比计为:0.1-0.5%的Tris、0.5-2%的PVP40、0.5-1 % 的 BSA、0.1-0.5% 的阳 G20000、2-5% 的薦糖、0.01-0.8%的1胖66肥0、0.02-0.1%的叠氮钢、 0.85-1.5 % 的NaCl、1-4% 的阳G 6000，余量为水。
[0010] 所述的样本包含但不限于血清、血浆、尿液等。所述纳米颗粒包括但不限于纳米 金、微球等。所述载体蛋白包括但不限于血清白蛋白（BSA)、多聚赖氨酸、卵清蛋白等。
[0011] 所述偶联试剂为碳二亚酷胺类或马来酷亚胺类;其中，碳二亚酷胺类为抓C，1-乙 基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺或N-径基班巧酷亚胺醋类(NHS醋）；马来酷亚胺类为4-马来酷亚胺基下酸-N-班巧酷亚胺醋(GMBS)或4-(N-马来酷亚胺基甲基)环己烧-1-簇酸班 巧酷亚胺醋(SMCC)。
[001引所述二乙酷精胺（DAS)分子偶联载体蛋白是：W碳二亚胺/N-径基班巧酷亚胺 化DC/NHS)作为偶联试剂，将活化处理后的载体蛋白加入至过量的0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8.0的PBS中，再加入水溶性的碳二亚胺化DC)和N-径基班巧酷亚胺(NHS)，混匀至清澈透明， 而后室溫下静置15-30分钟；静置后加入过量的乙酷精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值 至10-12,室溫下反应4-6小时;反应后经透析所得产物，即得二乙酷精胺(DAS)分子偶联载 体蛋白。
[0013]具体为:所述二乙酷精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是W碳二亚胺/N-径基班巧酷亚 胺化DC/NHS)作为偶联试剂，将活化处理后的6-15mg载体蛋白加入至0.01M-0.1M的PH = 6.5-8. OPBS 3-8mL中，再加入水溶性的碳二亚胺巧DC)7-lOmg和N-径基班巧酷亚胺(畑S)3-5mg，混匀至清澈透明，而后室溫下静置15-30分钟;静置后加入乙酷精胺，混匀至清澈透明， 调节体系PH值调至10-12,室溫下反应4-6小时；反应后经透析所得产物，即得二乙酷精胺 (DAS)分子偶联载体蛋白。
[0014]所述二乙酷精胺（DAS)分子偶联载体蛋白是：W碳二亚胺/N-径基班巧酷亚胺 化DC/NHS)作为偶联试剂，活化处理后的载体蛋白加入至过量的0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8.0 的PBS中，再加入水溶性的碳二亚胺化DC)和N-径基班巧酷亚胺(NHS)，混匀至清澈透明，而 后室溫下静置15-30分钟;静置后加入精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值调至10-12,室 溫下反应4-6小时;反应后经透析所得产物在2-8°C中，向反应体系内加入的酷化剂，而后再 于2-8°C下反应1-3小时，反应物在经透析即得二乙酷精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。
[0015] 具体为:所述二乙酷精胺(MS)分子偶联载体蛋白是：W碳二亚胺/N-径基班巧酷 亚胺化DC/NHS)作为偶联试剂时，将活化处理后的6-15mg载体蛋白加入至0.0 lM-O. IM的pH =6.5-8.OPBS 3-8血中，再加入水溶性的碳二亚胺巧DC)7-10mg和N-径基班巧酷亚胺(NHS) 3-5mg，混匀至清澈透明，而后室溫下静置15-30分钟;静置后加入精胺，混匀至清澈透明，调 节体系PH值调至10-12,室溫下反应4-6小时；反应后经透析所得产物在2-8°C中，向3-lOmL 反应体系内加入40化-8化L的酷化剂，而后再于2-8°C下反应1-3小时，反应物在经透析即得 二乙酷精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。
[0016] 所述二乙酷精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是WN-[丫-马来酷亚胺下酷氧]班巧酷 亚胺醋(GMBS)作为偶联试剂，将酷化剂（乙酸酢或无水乙酸或乙酷氯）与精胺在2-8°C下反 应60-90min，反应后与偶联剂(GMBS)在0.0 lM-O. IM的pH=6.5-8.0的PBS中混合，室溫下反 应3-4小时，得乙酷精胺-GMBS偶联产物;将载体蛋白与的乙酷琉基班巧酸在0.0IM-O. IM的 抑=6.5-8.0的PBS中混合，室溫下反应3-5小时;反应后加入O. IM径胺，室溫下反应30-35分 钟除去乙酷基;0.0 lM-O. IM的PH=6.5-8.0的PBS中透析，得琉基化修饰的BSA;将乙酷精胺-GMBS偶联产物与上述琉基化修饰的BSA混合，室溫下反应4-6小时；0.01M-0.1 M的抑= 6.5-8.0的PBS中透析得二乙酷精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。
[0017] 具体为:所述二乙酷精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是：WN-[丫-马来酷亚胺下酷 氧]班巧酷亚胺醋(GMBS)作为偶联试剂，将10-1扣L的酷化剂与15-25mg精胺在2-8°C下反应 60-90min，反应后与2-4mg偶联剂(GMBS)在0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8. OPBS 3-5mL缓冲溶液 中混合，室溫下反应3-4小时，得乙酷精胺-GMBS偶联产物;将8-15mg载体蛋白与3-7mg的乙 酷琉基班巧酸在0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8. OPBS 3-5mL缓冲溶液中混合，室溫下反应3-5小 时；反应后加入0 . IM径胺，室溫下反应30-35分钟除去乙酷基；0 . OlM-O . IM的pH = 6.5-8. OPBS缓冲液中透析，得琉基化修饰的BSA;将乙酷精胺-GMBS偶联产物与上述琉基化修饰 的BSA混合，室溫下反应4-6小时；0.0 lM-O. IM的PH = 6.5-8. OPBS缓冲液中透析得二乙酷精 胺(DAS)分子偶联载体蛋白。
[0018] 所述载体蛋白活化处理是将载体蛋白用0.01M-0.1M pH = 6.5-8.0PBS缓冲液溶 解，溶解后加入MES，置于2-8°C环境中反应半小时。
[0019] 。所述酷化剂包括乙酸酢、无水乙酸或乙酷氯。
[0020] 利用所述试剂盒通过免疫比浊竞争抑制法检测样本中的二乙酷精胺。
[0021] 具体是，二乙酷精胺(NI ,Ni2-Diacetylspermine,简称DAS)分子式为Ci4曲日N402,分 子量286.41，是一种多胺的二乙酷基衍生物，在体内由鸟氨酸经鸟氨酸脱簇酶作用生成。 DAS本身为小分子物质，是半抗原，不具备免疫原性，仅具有反应原性，无法使用DAS本身作 为免疫原制备DAS抗体，需将DAS通过偶联剂与载体蛋白偶联制备成完整的抗原，通过完全 抗原免疫动物才可能获得相应的DAS抗体。
[0022]其检测方法原理为:载体蛋白偶联的DAS抗原能与纳米颗粒上的抗DAS单克隆抗体 进行特异性结合形成免疫复合物，出现浊度;尿液中的DAS与载体蛋白偶联的DAS竞争性结 合DAS单克隆抗体。通过生化分析仪测定溶液浊度。浊度与尿液中DAS的含量成反比。通过测 定标准品，建立一条反应度对应浓度的标准曲线，即可测定尿样中DAS浓度值。
[002引D A S试剂盒的预期用途为体外定量检测人尿液中二乙酷精胺（N1，N 1 2 -Diacetylspermine ,DAS)的含量。
[0024] 本发明所具有的优点：
[0025] 本发明所采用的体外检测试剂盒的内容物中包括针对DAS的特异性单克隆抗体和 纳米颗粒标记测定所需试剂，与新型纳米颗粒免疫检测方法相结合，用于检测人体生物