单克隆抗体（由上述实施例7制备获得）。
[0191] 所述的样本包含但不限于血清、血浆、尿液。所述纳米颗粒包括但不限于纳米金、 微球。
[0192] 所述保护液按重量百分比计为:0.1-0.5 %的化is、0.5-2%的PVP 40、0.5-1 %的 BSA、0.1-0.5%的阳G20000、2-5%的薦糖、0.01-0.8%的TWEEN20、0.02-0.1%的叠氮钢、 0.85-1.5 % 的NaCl、1-4% 的阳G 6000，余量为水。
[0193] 所述Rl试剂的制备：
[0194] 1.准备SOmM P册.0的MES缓冲液，用来活化纳米颗粒，使其终浓度为1 %w/v。
[0195] 2.每毫升纳米颗粒悬液加入20mg的邸C，室溫解育20min。
[0196] 3.12000rpm离屯、30min，用等体积的包被缓冲液（IOOmM胎pes pH7.0含DAS抗体 lOOiig/mL)悬浮，室溫解育2-5小时。
[0197] 4.每毫升反应溶液中加入2.化L乙醇胺，持续揽拌并室溫解育lOmin。
[0198] 5.12000巧m离屯、30min，用保护液悬浮。
[0199] R2试剂为800ng/mL BSA偶联的DAS抗原；
[0200] 标准品为经水梯度稀释的DAS标准品，梯度稀释浓度为0nM、25化M、500nM、750nM、 1000 nM 5个浓度。
[0201 ] Rl与R2的体积比为= 150:40
[0202] 检测
[0203] 采用上述实施例的体外检测试剂盒进行体外检测，并与化ISA检测方法进行对比：
[0204] (1)采集40例生物样品（即人体尿液)立即于30分钟内，4°C条件下离屯、取上清作为 待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20°C保存备用；
[020引（2)取出试剂Rl、R2放置室溫下至溫度平衡；
[0206] (3)将Rl、R2试剂和DAS标准品放在生化分析仪相应的位置，制定标准曲线(表2和 参见图1);
[0207]表 2
[0209] (4)通过全自动生化分析仪检测DAS质控品，设置加入Rl试剂15化L，R2试剂40化， 加入样本扣L，第22点作为第一点检测，第45点为第二点检测，W两点差值为检测值，通过标 准曲线回归，确定检测结果有效性(参见表3);
[0引0] 表3
[0212] (5)用全自动生化分析仪检测DAS样本，设置加入Rl试剂15化L，R2试剂40化，加入 样本扣L，第22点作为第一点检测，第45点为第二点检测，W两点差值为检测值，通过标准曲 线回归得出最终结果。
[0213] (6)采用本发明方式与化ISA方法检测DAS样本检测结果参见表4、图2，通过化ISA 法测定值为横坐标，本法测定值为纵坐标，利用相关软件做一条直线如图3所示。
[0引4] 表4两种方法检测DAS含量结果
[0215]
[0217]由表4和图2可见通过比值可W看出，两种方法检测DAS含量趋势一致，由图3可W 看出，线性方程为y = 0.5714x-68.630，r2 = 0.9272相关系数r = 0.9629(图3所示），结果表 明，两种方法测定的DAS值密切相关。且本发明方法检测DAS用生化试剂盒与化ISA方法相 比，检测时间仅为l〇-15min，节约大量的时间，操作简便、快捷。
[021引实施例9
[0219] 试剂盒包括Rl试剂，R2试剂，标准品和质控品。
[0220] 所述Rl试剂的配制，取ImL纳米金加化L的0.2M K2CO3;混合后加入15iig DAS抗体， 混匀静置IOmin;再加10化封闭液进行封闭，再次混匀静置IOmin;离屯、IOmin，转速为SOOOr/ min,弃上清，沉淀用ImL Rl保护液复溶。
[0221] Rl保护液按重量百分比计为：0.3 %的Tri S、2 %的PVP 40、1 %的BSA、0.1 %的 阳G20000、5 %的薦糖、0.1 % TWEEN 20、0.04%叠氮钢、1 %的化Cl、4%的阳G 6000，余量为 水。
[0222] R2试剂为800ng/mLBSA偶联的DAS抗原；
[0223] 标准品为经水梯度稀释的DAS标准品，梯度稀释浓度为0nM、25化M、500nM、750nM、 1000 nM 5个浓度。
[0224] Rl与R2的体积比为= 150:40 [022引 实施例10
[0226] 试剂盒包括Rl试剂，R2试剂，复溶液，标准品和质控品。
[0227] 所述Rl试剂制备：是按照实施例8中Rl配制好后分装，放入冷冻干燥机内进行冻 干，使用时再将Rl试剂用复溶液复溶。
[022引所述复溶液为：Rl保护液按重量百分比计为：0.3 %的TriS、2 %的PVP40、1 %的 BSA、0.1%的阳G20000、5%的薦糖、0.1%TWEEN20、0.04%叠氮钢、1%的化C1、4%的PEG 6000,余量为水。
[0229] 所述其他成分与实施例8相同。
[0230] 本发明方法与对比例检测DAS样本检测结果如下表5所示。
[0231] 表5
[0234]通过上述结果表明，Rl试剂W液体形式和冻干形式检测DAS含量数值相差不大，均 符合产品使用要求。
【主权项】
1. 一种二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，包括R1试剂，R2试剂，标准品和 质控品，其特征在于:所述R1试剂为将二乙酰精胺抗体偶联在纳米颗粒上，并添加保护液 后，以液体形态或者冻干后的固定形态保存的试剂;所述的R2试剂为将乙酰精胺(DAS)分子 通过偶联试剂偶联在载体蛋白上，以液体形态或者冻干后的固体形态保存的试剂。2. 按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于:所 述二乙酰精胺抗体是以乙酰精胺(DAS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上所得的产物作 为免疫原，免疫动物得多克隆抗体或经师选得单克隆抗体。3. 按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于:所 述R1中保护液按重量百分比计为：〇. 1-0.5%的Tris、0.5-2%的PVP 40、0.5-1 %的BSA、 0 · 1-0 · 5% 的PEG20000、2-5% 的蔗糖、0 · 01-0 · 8% 的TWEEN 20、0 · 02-0 · 1 % 的叠氮钠、0 · 85-1.5%的NaCl、1-4%的PEG 6000,余量为水。4. 按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于:所 述偶联试剂为碳二亚酰胺类或马来酰亚胺类;其中，碳二亚酰胺类为EDC，1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯）；马来酰亚胺类为4-马来酰亚胺 基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯 (SMCC) 〇5. 按权利要求2或4所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于： 所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为 偶联试剂，将活化处理后的载体蛋白加入至过量的〇. 01M-0.1M的pH = 6.5-8.0的roS中，再 加入水溶性的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀至清澈透明，而后室温下静 置15-30分钟；静置后加入过量的乙酰精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值调至10-12,室 温下反应4-6小时;反应后经透析所得产物，即得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。6. 按权利要求2或4所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于： 所述二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白是以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)作为 偶联试剂，将活化处理后的载体蛋白加入至过量的〇. 01M-0.1M的pH = 6.5-8.0的roS中，再 加入水溶性的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀至清澈透明，而后室温下静 置15-30分钟;静置后加入精胺，混匀至清澈透明，调节体系PH值调至10-12，室温下反应4-6 小时;反应后经透析所得产物在2-8°C中，向反应体系内加入酰化剂，而后再于2-8°C下反应 1-3小时，反应物经透析即得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。7. 按权利要求2或4所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于： 所述二乙酰精胺（DAS)分子偶联载体蛋白是以Ν-[ γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯 (GMBS)作为偶联试剂，将酰化剂（乙酸酐或无水乙酸或乙酰氯）与精胺在2-8°C下反应60-90min，反应后与偶联剂(GMBS)在0.01M-0.1M的pH=6.5-8.0的roS中混合，室温下反应3-4 小时，得乙酰精胺-GMBS偶联产物;将载体蛋白与乙酰巯基琥珀酸在0.01M-0.1M的pH=6.5-8.0的PBS中混合，室温下反应3-5小时;反应后加入0.1M轻胺，室温下反应30-35分钟除去乙 酰基;0.01M-0.1M的pH=6.5-8.0的PBS中透析，得巯基化修饰的BSA;将乙酰精胺-GMBS偶联 产物与上述巯基化修饰的BSA混合，室温下反应4-6小时；0.01M-0.1M的pH = 6.5-8.0的PBS 中透析得二乙酰精胺(DAS)分子偶联载体蛋白。8. 按权利要求1所述的二乙酰精胺(DAS)免疫比浊法体外检测试剂盒，其特征在于:利 用所述试剂盒通过免疫比浊竞争抑制法检测样本中的二乙酰精胺。
【专利摘要】本发明涉及检测二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine,简称DAS)含量的方法，具体的说是一种用于二乙酰精胺(DAS)含量检测的试剂盒，试剂盒使用的抗原、抗体的制备方法以及试剂盒的研制方法和制备方案。本发明试剂盒优化了DAS含量检测方法，与传统ELISA方法相比，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响、可大批量样本测试使用等优势。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105527434
【申请号】CN201511020936
【发明人】李文欣, 朱明光, 刘峰, 宫晓丽, 王帅
【申请人】辽宁迈迪生物科技有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月31日