雄均可）1只，6~10周龄，体重18~22克。
[011U 3、实验方法
[0112] 3.1将Ba化/c或昆明小鼠拉颈脱白处死，浸泡于75%酒精5分钟，随即放入超净工 作台内，腹部朝上放于平皿内；
[0113] 3.2用眼科綴子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，W免腹 腔液外流，然后用剪刀向上下两侧做纯性分离，充分暴露腹膜，用酒精棉球擦拭腹膜消毒；
[0114] 3.3用注射器吸取不完全培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，晃动小鼠或反 复抽吸几次，用原注射器抽回腹腔内液体，注入离屯、管；
[0115] 3.41000巧111离屯、1〇111；[]1，弃上清；
[0116] 3.5用IOml完全培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为每毫升20万个，IOOiil/孔 滴加到96孔细胞培养板，置37°C，5 % C02培养箱中培养备用；
[0117] 3.6观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多 角形、细胞透亮、折光性强。
[om](二）、细胞融合
[0119] 1、试剂耗材
[0120] 1.1眼科綴子、剪刀数把、固定板
[0121] 1.2 37°C溫水
[0122] 1.3酒精灯、离屯、管、离屯、机、平皿
[0123] 1.4 融合剂:50%PEG，W=4000(37°C 预热）
[0124] 1.5 RPMI-1640不完全培养液(37°C预热）
[012引1.6 RPMI-1640完全培养液(37°C预热）
[0126] 1.7 HAT培养液添加剂(37°C预热）
[0127] 2、制备脾细胞悬液
[0128] 取加强免疫4#小鼠，眼眶采血后脱白处死，在75%酒精中侵泡消毒后无菌条件下 取出脾脏，制成脾细胞悬液，离屯、，100化pmaOmin，不完全培养液洗涂两次，计数，待用；
[0129] 3、制备骨髓瘤细胞悬液
[0130] 取3瓶生长状态良好的（活细胞数>95%)骨髓瘤细胞，使用无菌滴管对培养瓶内细 胞进行吹吸，然后将细胞悬液转移到50ml离屯、管中，离屯、，100化pmaOmin，使用不完全培养 液洗涂两次，计数，待用；
[0131] 4、细胞融合
[013引4.1将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的数量比例混合在一起，使用50ml离屯、管 离屯、，用不完全培养液洗1次，100化pm，IOmin;
[0133] 4.2弃上清，用滴管吸净残留液体，W免影响PEG的浓度；
[0134] 4.3轻轻弹击离屯、管底，使细胞沉淀略加松动；
[013引4.4在室溫下融合
[0136] ①1分钟内加入预热的Iml 50%PEG(分子量4000)，边加边摇晃；
[0137] ②作用90秒钟；
[0138] ③加预热的RPMI-1640不完全培养液，终止阳G作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml， 3ml，4ml，5ml和IOml预热的RPMI-1640不完全培养液；
[0139] 4.5 离屯、，:L OOOrpm, IOmin;
[0140] 4.6弃上清，先用6ml左右含20 %小牛血清的RPMI1640完全培养液轻轻混悬细胞， 切记不能用力吹打，W免使融合在一起的细胞散开；
[0141] 4.7根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液(RPMI-1640完全培养液，每50ml 完全培养液内添加 ImlHAT培养液添加剂）；
[0142] 4.8将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，IOOiil/孔，37°C、5%C02培 养箱培养；
[0143] 四、杂交瘤细胞筛选
[0144] (一）、HAT选择杂交瘤
[0145] HAT选择培养基含有次黄嚷岭、氨基噪岭和胸腺喀晚，其中氨基噪岭可阻断DNA合 成的主要途径。主要途径阻断后，靠依应急途径即在HGPRT(次黄嚷岭鸟嚷岭憐酸核糖转移 酶)和TK(胸巧激酶)作用下，利用胸腺喀晚和次黄嚷岭合成DNA，缺少其中一种，DNA合成不 能发生。用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞， 细胞内均无 TK或HGPRT，所W单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。B细胞虽然有 HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传 代，因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。
[0146] (二）、细胞培养、换液
[0147] 细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有 无污染、饲养细胞的状况。培养3~5天HAT培养液换液一次，10天换HT培养液培养至20天，换 1640完全培养液。
[0148] (S)、筛选分泌抗体的杂交瘤细胞（W其中一块培养板附图）
[0149] 融合后当杂交瘤细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体 活性。一般常用的有:免疫巧光、放射免疫(RIA)、组织化学法和酶联免疫分析化LISA)法等。 最经常用方法是化ISA法。在收集上清时，应在上次换液后3-4天进行，W便抗体积累。上清 可不经稀释或1:5-1:10稀释后再测抗体活性，用稀释抗体进行筛选时可W筛掉弱阳性的抗 体，也可W去掉因高本底所造成的假阳性，检测方法如下：
[0150] 1、抗血清活性检测化LISA法检测抗血清活性）
[0151] 1.1抗原包被
[0152] 纯抗原浓度2mg/ml，用包被液稀释后取10化1加入聚苯乙締酶联检测板各孔中，4 °C过夜后，洗液洗涂3次。
[015引 1.2封闭
[0154]每孔加 20化1封闭液，4°C过夜或37°C两小时后，洗涂3次，拍干。置4°C冰箱保存备 用。
[015引 1.3 ELISA检测
[0156] 1)吸取待检测培养孔的细胞上清，100山/孔，W不含细胞的培养基为阴性对照，W 阳性血清作为阳性对照，37°C解育SOmin，洗涂3次，拍干。
[0157] 2)加羊抗鼠-HRP，效价为105，10化1/孔，37°(3解育3〇111111，洗涂3次，拍干。
[015引 3)显色：加入A、B液各50iU/孔，37°C显色15min。
[0159] 4)终止:加入终止液50iil/孔。
[0160] 5)读数：W450nm，630nm双波长测定各孔OD值，W与阴性对照孔OD值的比值(P/N) 大于2.1为限(参见表1)。
[0161]表1
[0163] 2、抗血清活性检测(胶体金试纸条检测）
[0164] 2.1试纸条制作：
[0165] 标记金垫：525皿胶体金，按6/25体积比例加 K2C03和羊抗鼠 IgG，摇床摇IOmin，加 10%酪蛋白，封闭IOmin，离屯、，复溶，铺金，抽干；
[0166] 包被:ASP-P化，12mg/mL，用1冲BS稀释5倍，包被SOuL/板，划一条线；
[0167] 组装:PVC板上自上到下依次为:吸水纸，NC膜，金垫(2层6mm)，加样垫；
[016引切条:3mm/条切条；
[0169] 2.2 检测：
[0170] 加样50-lOOul细胞上清液，静止20min，对比显色线显色强弱，判断细胞培养基中 抗体活性强弱，显色越强，抗体活性越高。
[0171] 由上述，两种方法的检测结果经比较发现，酶联检测数值高的，胶体金试纸条检测 线显色深，检测结果一致，故W后的抗体筛选采用胶体金试纸条法。
[0172] 五、杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法）
[0173] 融合细胞经抗体活性筛选后，进行亚克隆，挑选出单克隆细胞株，步骤如下：
[0174] 1、在96孔细胞培养板中每孔依次加入10化1饲养细胞悬液(约含2. OX 104个腹腔 细胞）；
[017引2、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含10%血清的HT培养基稀释至10个细胞/ml, 每孔接种量为0.1 ml细胞悬液，即每孔含1个细胞；
[0176] 3、37°C、5%C02培养7~10天，出现肉眼可见的克隆或者在倒置显微镜下能够观察 到杂交瘤细胞布满孔底1/3面积即可检测抗体;标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体 检测，
[0177] 4、取抗体检测阳性孔分离细胞，并转种于24孔板中扩大培养，并冻存；
[0178] 5、重复上诉1-4步骤2次，挑出经克隆化后所有含细胞孔均为阳性的单克隆细胞扩 大培养，保种冻存细胞。
[0179] 最后筛选出的成品细胞株编号:抓4A7A10
[0180] 六、单克隆抗体的生产
[0181] 将保种后的细胞再继续扩大培养，进行单克隆抗体的大量制备。
[0182] 1、成年Ba化/c小鼠（3月龄)腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.3~0.5ml，7天后使用；
[0183] 2、收集对数生长期的杂交瘤细胞，用生理盐水洗涂两次，15(K)r/min离屯、IOmin;
[0184] 3、取样，用台吩蓝染色，计数活细胞，重新用生理盐水配制成I X 106个细胞/ml的 悬液
[0185] 4、给每只小鼠腹腔注射Iml处于对数生长期的杂交瘤细胞；
[0186] 5、间隔5天后，每天观察小鼠腹水的产生情况，如腹部明显膨大，W手触摸时，皮肤 有紧张感，处死小鼠，采集腹水；
[0187] 6、400化/111；[]1离屯、腹水151]1；[]1，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，分装，-70 °C冻存备用；
[0188] 7、将编号为抓4A7A10的腹水，共计IOml,使用蛋白A层析柱纯化，并进行脱盐处理， 纯化后即为抗DAS抗体。
[0189] 实施例8
[0190] 试剂盒，包括Rl试剂，R2试剂，标准品和质控品，所述Rl试剂是将二乙酷精胺抗体 偶联在纳米颗粒上后添加保护液后液体形态或者冻干后的固定形态保存的试剂。所述的R2 试剂时将乙酷精胺(DAS)分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上后液体形态或者冻干后的固 体形态保存的试剂，由上述实施例1-5制备获得。所述二乙酷精胺抗体是由乙酷精胺(DAS) 分子通过偶联试剂偶联在载体蛋白上所得的产物作为免疫原，免疫动物所得多克隆抗体或 经筛选所得的