一种复合病毒半定量检测金标卡及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能实现百合三种病毒快速半定量检测的复合金标卡及制备方法，具体指运用胶体金免疫层析法，研制出同时能快速半定量检测百合X病毒(LVX)、百合李属坏死环斑病毒(PNRSV)和百合草莓潜隐环斑病毒(SLRSV)的复合金标卡及其制备方法。
【背景技术】
[0002]百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本植物，是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物;在中国，食用和药用百合产业发展较好;食用百合属于稀有特种蔬菜，是具有清热润肺、增强免疫力等保健功能的绿色食品，市场需求量很大，尤其是兰州百合以含糖量高，粗纤维少，肉质细腻，营养丰富而享有很高的声誉;对于切花百合，我国上世纪80年代末就开始了切花生产，但自繁百合种球病毒病等病害严重，种球质量难以达到国外同类产品的水平，目前国内百合切花生产中90%以上的种球依赖进口，每年进口百合种球1.5亿个，耗资巨大。
[0003]随着国内百合种植面积的扩大，加之进口种球质量参差不齐，无性繁殖使病毒广泛传播并积累，除了常见的百合斑驳病毒一Lily mottle virus, LMoV、百合黄瓜花叶病毒一Cucumber mosaic virus, CMV和百合隐症病毒一Lily symptomless virus, LSV)外，近年来，相继有百合X病毒(Lily virus X, LVX)、李属坏死环斑病毒(Prunus necroticringspot virus , PNRSV)和草莓潜隐环斑病毒(Strawberry latent ringspot virus ,SLRSV)等被报道可以侵染百合，且侵染率超过了 20%，造成百合叶片褪绿并出现黄条纹、叶畸形、植株矮化、产量以及品质下降等现象，严重时可引起毁灭性灾害。
[0004]LVX为马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员，LVX粒子无包膜，呈弯曲纤丝状，长470nm，直径13nm，外壳蛋白(CP)呈螺旋状，其上有模糊的沟状结构；LVX基因组由5823个核苷酸组成，3 ’-末端具有poly (A)尾巴，CP亚基分子量大小为22.0kDa左右;PNRSV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)，PNRSV是正单链的RNA病毒，核酸大小为8.056kb，PNRSV病毒粒子形态为等轴对称多面体，直径约为22_23nm，CP蛋白含一种亚基，分子量约为25.0kDa ； SLRSV隶属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus)，SLRSV是单链的RNA病毒，病毒粒子形态为球状，大小相等，直径30nm，CP蛋白包含大小两种亚基，分子量分别约为43.0和26.0 kDa。
[0005]经过大量的调查和田间取样检测，发现病毒病可使食用百合的产量由每亩1500公斤降至600公斤，甚至更少，2012年7月，兰州百合种植区域爆发了严重的病毒病灾害，导致大面积枯死，给农户带来了巨大的经济损失;病毒病已造成百合种源严重退化，已是制约百合产业发展的重要因素;如何对百合常见病毒实现全面、快速检测，已成为百合产业发展的迫切需要。
[0006]目前，对LVX、PNRSV和SLRSV检测的主要技术和方法有电子显微镜技术、酶联免疫法(ELISA)和核酸检测法(PCR)等，但这些技术和方法普遍存在检测程序复杂、耗时(6-7h/样)、分析费用高、对仪器和实验人员的技术水平要求高等问题，很难在生产中得到普遍推广应用；胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体;该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于包括烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等多种植物病毒的检测。
[0007]对于百合病毒，目前已有用胶体金免疫层析法检测LMoV和LSV等的相关报道(Zhang et al., 2015, J Virol Methods , 220)，但是其只能进行定性检测，也就是说检测结果仅能定性判断病毒的有或无，对于阳性结果无法得知被检样品病毒含量的差异，田间防治病毒时依旧盲目而缺乏科学依据，从而阻碍了该方法的广泛普及与推广。
[0008]近年来，通过我们对田间感病毒程度不同的百合叶片叶绿体超微结构、光合色素含量、防御酶活性等生理生化指标的测定和分析，发现许多阳性植株通常无明显症状，其叶绿体结构、光合色素含量以及株高、茎粗、叶片形状等生长指标与健康植株没有差异;而部分阳性植株叶片形成了轻微的斑驳条纹，叶绿体结构被部分破坏，光合色素含量以及株高、茎粗等生长指标显著低于健康植株;也发现少量的阳性植株出现了明显的斑驳条纹或坏死斑，叶片严重变小，植株严重矮化，生理测定发现其叶绿体结构被严重破坏，光合色素含量显著低于健康植株(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(1));进一步通过对病毒含量的Real-time PCR检测，证实出现严重症状的阳性植株，其病毒相对含量是无症状阳性植株的 1000倍以上(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(2));以上实验结果说明病毒含量的差异对百合生长影响的差异较大，所以对于感病程度不同的阳性植株应该采取不同的策略，科学管理、合理防治，最大程度降低病毒对百合生长的危害;可见，检测病毒含量的差异将对田间病毒管理起到非常重要的指导意义。
[0009]此外，目前对于百合病毒的防治主要以杀灭传播介体-蚜虫为主，对于如何科学地喷施抗百合病毒药剂，喷施抗病毒药剂后百合病毒增殖是否被抑制，若已抑制，抑制的程度如何等问题均没有相关报道，而这些问题的解决首先依赖于半定量检测；因此，实现半定量检测的意义重大。
[0010]本发明为了进一步提高胶体金免疫层析检测方法的使用效率和田间普及率，降低检测成本，实现对百合常见病毒的快速且半定量检测，我们通过对已有胶体金免疫层析技术进行不断优化和改进，采用了多向免疫层析技术，研制能一次性同时半定量检测LVX、PNRSV和SLRSV的复合金标卡，解决LVX、PNRSV和SLRSV单一半定量检测金标卡技术存在的单一性、局限性以及传统的百合病毒检测方法成本高、耗时长、对仪器设备和专业技能要求高等问题的束缚，让种植人员在田间便可掌握病毒快速检测技术，在健康种源的选择以及百合种植和生长的全过程内随时检测病毒，为百合病毒病的动态监测和防治提供数据支持。该LVX、PNRSV和SLRSV的多向复合金标卡的开发，将为加快百合产业化的发展、提高百合产区农业的经济效益，增加农民收入，促进脱贫致富做出贡献。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是运用胶体金免疫层析法研制一种能同时快速半定量检测三种百合病毒LVX、PNRSV和SLRSV的复合金标卡及其制备方法。
[0012]本发明金标卡可一次性同时快速半定量检测LVX、PNRSV和SLRSV，无需任何仪器和设备，便可准确检测样品之间三种病毒含量的差异;较LVX、PNRSV和SLRSV单一半定量检测金标卡，本发明金标卡检测效率更高，检测成本进一步降低，一次性检测病毒种类更齐全；此外，其操作简便，携带方便，检测快速，特异性强，重复性好;可见本发明特别适用于百合病毒的动态监测，也特别适合在田间推广应用，并且可靠性很高。
[0013]本发明的技术方案为:
一种百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡，包括:金标卡槽I，衬板26，样品垫18，第一胶体金结合垫19，第二胶体金结合垫21，第三胶体金结合垫23，第一硝酸纤维素膜20，第二硝酸纤维素膜22，第三硝酸纤维素膜24，吸水滤纸25，其特征在于:金标卡槽I包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有加样孔2、第一反应窗3、第二反应窗4和第三反应窗5，样品垫18置于加样孔2下方，第一硝酸纤维素膜20置于第一反应窗3下方，第二硝酸纤维素膜22置于第二反应窗4下方，第三硝酸纤维素膜24置于第三反应窗5下方，第一胶体金结合垫19上含有兔抗LVXIgG，第二胶体金结合垫21上含有兔抗PNRSV IgG，第三胶体金结合垫23上含有兔抗SLRSVIgG，衬板26固定于金标卡槽I中，样品垫18、第一胶体金结合垫19、第一硝酸纤维素膜20和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26右侧上表面，第二胶体金结合垫21、第二硝酸纤维素膜
22和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26下侧上表面，第三胶体金结合垫23、第三硝酸纤维素膜24和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26左侧上表面，第一硝酸纤维素膜20上设有第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8和第一对照线9，第二硝酸纤维素膜22上设有第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12和第二对照线13，第三硝酸纤维素膜24上设有第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16和第三对照线17，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗LVX IgG，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗PNRSV IgG，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗SLRSV IgG，第一对照线9、第二对照线13和第三对照线17上均包被的是羊抗兔IgG，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上LVX IgG包被量分别为1.5?2.0 pg、0.75?1.0 yg和1.5?2.0 yg蛋白，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上PNRSV IgG包被量分别为2.5?3.0 pg、1.25?1.5 yg和2.5?3.0 yg蛋白，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上兔抗SLRSV IgG包被量分别为2.5?3.0 pg、1.25?1.5 yg和2.5?3.0 yg蛋白，第一胶体金结合垫19上兔抗LVX IgG标记量为16 yg/mL，第二胶体金结合垫21上兔抗PNRSV IgG标记量为20 yg/mL，第三胶体金结合垫23上兔抗SLRSV IgG标记量为22 yg/mL，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.0yg蛋白ο
[0014]其中在用所述金标卡检测时，在所述加样孔处加入百合样品的待检溶液，对比第一反应窗、第二反应窗和第三反应窗内第一至第九检测线以及第一至第三对照线的颜色，即可判定被检百合是否感染了百合X病毒、李属坏死环斑病毒或草莓潜隐环斑病毒，若已感染，可以进一步判定被检测样品病毒含量的差异。
[0015]其中将待检溶液加入所述金标卡的加样孔内，若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带;金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二检测线7和第三检测线8方向渗移，当接触到所述第二检测线7和第三检测线8时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带;此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第二和第三对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二至第九检测线7、8、10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带;剩余的复合物继续往第二检测线7、第三检测线8方向渗移，当接触到第二检测线7时发生抗原抗体结合反应被全部截留下来，形成淡红色条带;剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三检测线8和第一对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线