遗传性血管水肿的检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测试剂盒领域，具体地说，涉及一种遗传性血管水肿的检测试剂盒 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 遗传性血管水肿化ereditary angioedema，HAE)是一种W反复发作的皮下和 (或）黏膜下水肿为主要表现的罕见遗传性疾病。水肿为自发性或由某些因素诱发，具有局 限性、非凹陷性、自限性的特点。常见受累部位包括颜面部、四肢、消化道及上呼吸道黏膜。
[0003] 典型的HAE是由补体Cl醋酶抑制剂（Clinhibitor，C1-INH)基因突变导致的 Cl-INH量的减少和（或）功能缺乏所致。遗传性血管水肿是一种常染色体先行遗传病，发 病率 1/50000。
[0004] 由于HAE发病率低，临床上易发生误诊、误治。该疾病的诊断除需要了解家族史和 根据典型的临床表现外，主要依赖于实验室对Cl-INH功能活性检测。近年来，国外较多推 荐采用比色法对Cl-INH的功能进行检测。但比色法的灵敏度和特异性较低，且操作较复 杂，用时较长。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种遗传性血管水肿的检 测试剂盒及其制备方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种遗传性血管水肿的检测试剂盒，所述 试剂盒包括；包被抗人Cl-INH抗体的载体、生物素标记的Cl-INH校准品、链霉亲和素偶联 的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B W及洗涂液。
[0007] 进一步地，所述载体为化学发光板或磁珠微粒。
[0008] 进一步地，所述抗人Cl-INH抗体选自鼠抗人Cl-INH单克隆抗体、兔抗人Cl-INH 多克隆抗体、羊抗人Cl-INH的多克隆抗体、鸡抗人Cl-INH多克隆抗体中的一种或多种。
[0009] 作为优选，所述抗人Cl-INH抗体选自鼠抗人Cl-INH单克隆抗体。
[0010] 进一步地，所述鼠抗人Cl-INH单克隆抗体的纯度不小于95%，浓度不小于Img/ HlL。
[0011] 作为优选，所述抗人Cl-INH抗体浓度为5 U g/血。
[0012] 本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括W下步骤：
[001引 （1)包被抗人Cl-INH抗体的载体的制备：
[0014] 包被抗人ClINH抗体的96孔化学发光板；将包被用抗人Cl-INH抗体加至碳酸盐 缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100 y L包被浓度1~5 U g/mL，4°C过夜，用含Tween 20 的磯酸盐缓冲液洗涂微孔板2遍后，再加入含有BSA的磯酸盐缓冲液，室温静置2小时后， 弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铅巧袋真空包装，放2-8C保存；
[0015] 或包被抗人Cl-INH抗体的磁珠微粒；将直径0. 15 U m的磁珠微粒用戊二醒活化， 室温混匀2~5小时候，用0.0 lmol/L PBS缓冲液冲洗4次，并将该溶液进行悬浮，浓度为 0.1 mg/mL~2. 5mg/mL ;然后，每毫升悬液中加入抗人Cl-INH抗体10 y g，于20~40°C混匀 赔育3~10小时；用等体积的0.0 lM PBS 2%~5% BSA pH7. 0~7. 4缓冲液于20~40°C 赔育2~8小时；最后，用2% BSA 0.0 l~0.1 M Tris-肥1 pH7. 5~抑9. 0缓冲液清洗H 次，并用该溶液配制成磁珠微粒浓度0. 1~1. Omg/mU即得；
[0016] (2)生物素标记的Cl-INH校准品的制备：将Cl-INH用0.1mol/L，P册.0的碳酸氨 钢缓冲液或0. 5mol/l，pH 8. 6的测酸缓冲液稀释到Img/mU并用0. lmol/1，pW. 0的碳酸 氨钢缓冲液或0. 5mol/L，抑8. 6的测酸缓冲液，对蛋白质充分透析；用ImL DMSO溶解畑SB Img ;向1血Cl-INH溶液（即含蛋白质Img)加入120 N服B溶液（即含畑SB 120 U g); 在室温下持续揽拌，保温2-4小时；加入9. 6 U Llmol/L NH4CI (每25 U g畑SB加1 U 1)，在 室温下揽拌10分钟；在4°C，对PBS充分透析，W除去游离的生物素；将样品上ImL的分子 筛柱，W PBS缓慢洗脱，收集ImL/管，蛋白质在l-3mL之间洗下；最后，样品加入叠氮钢（终 浓度0. 5g/L)及1. Og/L BSA.将结合产物置4°C，避光保存；
[0017] (3)链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂的制备：将链霉亲和素偶联的辣根过氧 化酶用2% BSA，0.0 lM Tris-肥1抑7. 4的缓冲液配制为0. Sug~Iug/血。
[0018] 本发明还进一步提供了前述试剂盒的应用：
[0019] 当包被抗人ClINH抗体的的载体为96孔化学发光板时，应用方法具体为：
[0020] 1)将浓度分别为 0U/mL、0. 12抓/mUO. 37抓/mUO. 6抓/mU 1. OU/mL、1. 2抓/mU 1. 抓/mL的Cl-INH校准品各100 U L依次加入到微孔板中，然后将50 U L患者血清加入微孔 中，然后加入50y L生物标记的C1-INH，室温或37°C赔育15min~45min ;
[002。。赔育结束后，洗板5次；
[002引扣加入100化链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂，室温或37°C赔育15min~ SOmin ；
[002引 4)赔育结束后，洗板5次；
[0024] 5)加入化学发光底物A液和底物B液各50 U L 5min后读数；
[002引6)建立校准品曲线，将样本检测孔化学发光值代入校准品曲线，计算出样本中的 Cl-INH的含量。
[0026] 当包被抗人ClINH抗体的的载体为磁珠微粒时，应用方法具体为：
[0027] 1)在校准品检测管中加入50 U L磁珠微粒试剂，加入50 U L校准品；在样本检 测管中加入50 U L磁珠微粒试剂，然后加入25 U L血清样本，再加入25 U L生物素标记的 Cl-INH校准品，37°C赔育5~15min ;
[0028] 2)将赔育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场， 震荡使磁珠微粒充分混悬；
[002引扣向步骤2中的检测管中加入100化链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂，37C 赔育5~15min ;
[0030] 4)将赔育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场， 震荡使磁珠微粒充分混悬；
[0031] 5)添加磁场，使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离，去除上清液，然后加入 发光底物A和底物B，取出磁场，充分混匀厚虽检测5min内相对发光强度值。
[0032] 本发明的有益效果在于：
[0033] 本发明提供了一种化学发光免疫分析法用于Cl-INH的检测，达到对遗传性血管 水肿疾病的诊断。相比比色法，化学发光免疫分析法，灵敏度和特异性更高，临床上，操作更 简单，对于多样本实验室，相比比色法，操作时间更短，能用于全自动或半自动发光免疫分 析仪。
【附图说明】
[0034] 图1为0浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线（化学发光板为包被载体试剂盒）。
[0035] 图2为0浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线（磁珠微粒为包被载体试剂盒）。
[0036] 图3为试剂盒校准品曲线（化学发光板为包被载体试剂盒）。
[0037] 图4为试剂盒校准品曲线（磁珠微粒为包被载体试剂盒）。
【具体实施方式】
[003引 W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0039] 实施例1包被抗人Cl-INH抗体载体为96孔化学发光板检测试剂盒的制备
[0040] (一）化学发光板的制备：
[0041] 鼠抗人Cl-INH单克隆抗体由北京新华联协和药业有限责任公司制备；。将鼠抗 人Cl-INH用50mM碳酸盐缓冲液NazCOsl. 59g/L和Na肥032. 93g/L稀释到2. 5 U g/ml，加至 对应发光板内，每孔100 U L，4°C赔育过夜，用含Tween 20的磯酸缓冲液洗涂发光板3遍后， 再加入含有BSA的磯酸盐缓冲液（化C18. Og/L、KCl 2. Og/L、胞2册〇42. 87g/L、KH2PO4O. 2g/ L、Tween 200. 5ml/L、5% BSA)，室温静置化后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铅袋真 空包装，完成变应原包被的预包被发光板的制备。
[004引（二）生物素标记Cl-INH校准品的制备
[004引将Cl-INH用0.1mol/L碳酸氨钢缓冲液（pH 8. 0)或0. 5mol/L测酸缓冲液（pH 8. 6)稀释到Img/ml，并用0.1mol/L碳酸氨钢缓冲液（pH 8. 0)或0. 5mol/L测酸缓冲液 (pH 8. 6)，对蛋白质充分透析；用Iml DMSO溶解畑SB Img;向ImlCl-INH溶液（即含蛋白 质Img)加入120化N服B溶液（即含畑SB 120 U g);在室温下持续揽拌，保温2-4小时； 加入9. 6 y Llmol/L畑仍（每25 U g N服B加1 y L)，在室温下揽拌10分钟；在4°C，对PBS 充分透析，W除去游离的生物素；将样品上Iml的分子筛柱，W PBS缓慢洗脱，收集Iml/管， 蛋白质在l-3ml之间洗下；最后,样品加入畳氮钢（终浓度0. 5g/L)及1. Og/L BSA.将结合 产物置4°C，避光保存。
[0044] ( H )链霉亲和素偶联的辣根化酶试剂制备
[0045] 链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶购自Sigma,用2% BSA 0.0 lM Tris-肥1 pH7. 4 的缓冲液配制为0. 5 y g~1 y g/ml。
[0046] 实施例2包被抗人Cl-INH抗体载体为磁珠微粒检测试剂盒的制备
[0047] (一）磁珠微粒试剂的制备
[004引将直径0. 15 U m的磁珠微粒用戊二醒活化，室温混匀4小时，用0.0 lmol/L PBS缓 冲液冲洗4次，并将该溶液进行悬浮，浓度为Img/ml ;然后，每毫升悬液中加入