一种旱稻孢囊线虫LAMP快速检测方法与流程

本发明涉及一种旱稻孢囊线虫lamp快速检测方法，属于生物技术领域。

背景技术：

旱稻孢囊线虫(heteroderaelachista)是一种主要侵染水稻的植物寄生线虫，最早于日本枥木县的稻田中被发现(ohshimay.heteroderaelachistansp.anuplandricecystnematodefromjapan[j].japanesejournalofnematology，1974(4):51-56.)。目前该线虫病害在湖南省多个县(市)丘陵地带的水稻田首次发现(dingz，namphuengj，hexf.firstreportofthecystnematode(heteroderaelachista)onriceinhunanprovince,china[j].plantdisease,2012,96(1):151)。旱稻孢囊线虫一般寄生在寄主根部，其危害症状与水肥失调引起的症状极其相似，除吸收寄主的营养和对植物根部造成伤害外，还降低水稻对水的利用效率，继而影响寄主的生长和发育(丁中,namphuengjanthathang,何旭峰等.旱稻孢囊线虫生活史及侵染特性[j].中国水稻科学,2012,26(6):746-750)，造成水稻减产7％～19％(bridgej，lucm，plowrightra.plantparasiticnematodesintropicalandsubtropicalagriculture[m].wallingford：cabinternational,1990:69–108)。目前旱稻孢囊线虫病主要发生在长江中下游水稻种植区，且危害日趋严重，有可能成为我国的水稻生产中的又一严重威胁，同时该线虫病害的发生分布还不十分的明确，对该线虫做出快速准确的鉴定是当前麦类作物生产急需解决的问题。

旱稻孢囊线虫属于cyperi群组，在形态上与h.oryzae、h.sacchari和h.leuceilyma非常相近。其与h.sacchari和h.leuceilyma最明显的区别是在孢囊细长的下桥上缺乏指形的投影，而与h.oryzae相比，孢囊略小，二龄幼虫长度略短。目前旱稻孢囊线虫的鉴定大部分仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，但是由于形态学鉴定耗时、需要很熟练的技术作为基础，并且需要专门从事分类的人员来完成，这些原因使传统的鉴定方法时常存在一定误差并且不适用于大规模的样品检测。

近年来，随着分子生物学的快速发展，pcr等快速检测技术已经广泛的运用到植物线虫的快速检测和鉴定中。目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括its-rflp,pcr，realtimepcr等。

amiri等通过对h.betae、h.ciceri、h.glycines和h.medicaginis、h.schachtii、h.trifolii的its序列进行分析，筛选出特异性引物shf6，将此引物与ab28(或rdna2)引物结合，构建了甜菜孢囊线虫一步双重pcr的检测方法(amiris.,subbotins.a.,moensm.,anefficientmethodforidentificationoftheheteroderaschachtiisensustrictogroupusingpcrwithspecificprimers.nematol.medit.2001,29:241-246)。subbotinsa,pengdl,moensm.运用双重pcr检测大豆孢囊线虫的方法，在一个pcr反应体系中同时运用通用引物d3a和d3b以及特异性引物glyf1和rdna2，从52个大豆孢囊线虫群体中均扩增出两个dna片断(181bpand345bp)，检测的敏感度高达单个孢囊、单头二龄幼虫的微量dna(subbotons.a.,pengdl,moensm.,arapidmethodfortheidentificationofthesoybeancystnematodeheteroderaglycinesusingduplexpcr.nematology2001,vol.3(4):365-371)。

国内外已经有关于旱稻孢囊线虫pcr快速检测技术研究。彭德良等根据旱稻孢囊线虫特异性rapd扩增片段，设计特异性scar标记引物hef1和her1，可扩增出434bp的特异性片段(发明专利：旱稻孢囊线虫旱稻孢囊线虫特异性rapd和scar标记快速分子检测方法-cn201210200140.4)；丁中等根据旱稻孢囊线虫its序列开发出特异性检测旱稻孢囊线虫的pcr方法，该特异性引物可在旱稻孢囊线虫群体特异性扩增出281bp的片段，其灵敏度达1/256条2龄幼虫(发明专利特异性检测旱稻孢囊线虫的pcr方法-cn201210322051.7)。

循环恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofdna，lamp)是2000年日本荣研株式会社notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。(notomit，okayamah，masubuchih，yonekawat,watanabek,aminonandhaset.loop-mediatedisothermalamplificationofdna[j].nucleicacidsres，2000，28(12):e63.)，该技术通过识别靶序列上6个特异区域的特异性引物和利用具有链置换功能的bstdna聚合酶，在恒温条件下能特异、高敏、快速地扩增靶序列。2008年日本科学家首次利用lamp技术建立了从病木中直接检测松材线虫lamp检测的方法(kikuchit,aikawat,oeday,karimn,kanzakin.arapidandprecisediagnosticmethodfordetectingthepinewoodnematodebursaphelenchusxylophilusbyloop-mediatedisothermalamplification.nematology,2009,12:1365-1369)。随后在建立了南方根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、香蕉穿孔线虫、柑橘半穿刺线虫等重要病原线虫的lamp检测技术(niujh,guoqx,jianh,chencl,yangd,liuq,guoyd.rapiddetectionofmeloidogynespp.bylampassayinsoilandroots.cropprotection,2011,8:1063-1069；niujh,jianh,guoqx,chencl,wangxy,liuq,guoyd.evaluationofloop-mediatedisothermalamplification(lamp)assaysbasedon5srdna-igs2regionsfordetectingmeloidogyneenterolobii.plantpathology,2011,02562.x；pengh,pengdl,huxq,hexf,wangq,huangwk,hewt.loop-mediatedisothermalamplificationforrapidandprecisedetectionoftheburrowingnematode,radopholussimilis,directlyfromdiseasedplanttissues.nematology，2012,14(8):977-986.)灵敏度比常规pcr检测高10-100倍。lamp检测技术在旱稻孢囊线虫上尚无相关报道，本发明首次建立了旱稻孢囊线虫lamp快速检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是建立循环恒温扩增技术(lamp)检测旱稻孢囊线虫的lamp快速检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性强等特点，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。

一种旱稻孢囊线虫lamp快速检测方法，其特征在于：其中lamp反应体系所使用的引物是：

1)he-f3：5’-gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3：5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip：5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip：5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb：5’-aggttggagctgggatgcg-3’

其中的he-fip采用荧光基团标记，5`段采用生物素标记。

其中的lamp反应体系包括：

(1)引物混合液：外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，内引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,环引物he-lb为0.4μmol/l；

(2)反应混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgs04,10mmol/l(nh4)2s04,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；

(3)1μldna模板；

加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

其中lamp反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μldna模板，61～65℃温育30～90min，85℃保温5min。

还包括lamp反应后的鉴定步骤，所述鉴定步骤包括显色鉴定或电泳图鉴定。

所述显色鉴定为在扩增反应产物中加入的显色剂为100倍sybrgreeni，以肉眼观察显色结果，显绿色荧光的为旱稻孢囊线虫。

所述电泳图鉴定为电泳图显示为梯形条带的为旱稻孢囊线虫。

所述电泳图鉴定为在扩增反应产物中加入探针，杂交后，插入lfd试纸，发现同时存在测试带和控制带，所述探针的序列为：

he-probe：5-cgccgaggttggagctgggatgc-3`，

所述探针5`段采用fitc标记。

上述任一检测方法在旱稻孢囊线虫早期诊断和辅助鉴定中应用。

本发明利用循环恒温扩增技术建立针对旱稻孢囊线虫的lamp检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于lamp反应操作步骤简单及反应产物经荧光显色后，结果可以通过肉眼直接判定，适用于各种实验条件下检测工作的使用,特别适合在实验条件不足的室外检测。

本发明的方案具体实施步骤如下：

1.dna的提取

挑取单个旱稻孢囊放入装有10μlddh2o的0.2ml离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用无菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μl的10倍pcr缓冲液，2μl的600μg/ml蛋白酶k溶液，然后在-80℃下冷冻30min。将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫dna模板直接用于lamp和pcr反应。

2.旱稻孢囊线虫lamp引物设计

根据ncbi中旱稻孢囊线虫its-rdna序列(genbank登录号：jn_257082,kc_618466,kf_430213andkm_017067)及其近源种heteroderaoryzicola(af_274387)、h.cyperi(af_274388)、h.mothi(af_498392)等its序列，通过比对后，选择旱稻孢囊线虫特异区域，采用primerexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html).在线软件设计、实验筛选出以下5条特意性强，稳定性高的引物，序列如下:

1)he-f3:5’-gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3:5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb5’-aggttggagctgggatgcg-3’

3.lamp反应体系配置

外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，内引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,环引物he-lb为0.4μmol/l；反应混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgso4,10mmol/l(nh4)2so4,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；1μldna模板；加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

lamp反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μldna模板，61～65℃温育30～90min，85℃保温5min。

lamp结果结果可以采用以下三种检测方法：

1)将上述反应完的体系中加入1μl的显色剂。轻晃混匀，即可观察；

2)取2μl扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；

3)扩增产物种加入1μlfitc标记的探针(10μm)，65℃保温5min后，自然冷却至室温，取10ul杂交液，加入到100μlofbps缓冲液中，插入一根lfd试纸，静置5-15min观察。4.结果观察

在最佳反应体系和反应条件下，旱稻孢囊线虫阳性反应的凝胶电泳能够观察到典型的阶梯状条带。此外，加入sybrgreeni染色剂后，肉眼可以观察到lamp产物变成绿色，且在侧向层析监测中，测试线和对照线均出现条带。而使用其他种线虫dna进行lamp无法得到阳性结果，表明lamp方法准确度高；本发明lamp检测体系能够检测到1/20000头旱稻孢囊线虫，比常规pcr检测灵敏10倍，具有极高的灵敏度。

综上所述，本发明比现有的检测旱稻孢囊线虫方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中进行现场应用检测。该技术可应用于对旱稻孢囊线虫田间土壤样品及小麦孢囊线虫病的发生早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为旱稻孢囊线虫lamp引物设计示意图，

图2为旱稻孢囊线虫lamp方法检测，

a为加荧光染料检测结果，1，2：阳性结果，具有绿色荧光，3：阴性对照，为棕色。

b检测结果为电泳图，m:100bpdna标准分子量；1，2：阳性结果，为lamp扩增梯形条带，3：阴性对照，无扩增产物。

c检测结果为电泳图，1，2：阳性结果同时具有控制线和测试线；3：阴性对照，只有控制线。

图3为旱稻孢囊线虫灵敏度检测结果

a为lamp检测电泳图，m：1000dna标准分子量，单头孢囊，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照(ck)。

b为普通pcr法检测电泳图，m：100dna标准分子量，，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4个孢囊及阴性对照(ck)。

图4为旱稻孢囊线虫lamp特异性检测结果

1-7为旱稻孢囊线虫(he01、he02、he03、he04、he05、he06、he07)，8-22分别为南方根结线虫(mi01andmi02),象耳豆根结线虫(me01),拟禾本科根结线虫(mg01andmg02),北方根结线虫m.hapla,爪哇根结线虫(mj),花生根结线虫(ma),水稻潜根线虫(ho01andho02),h.mucronata,禾谷孢囊线虫(ha),菲利普孢囊线虫(hf),玉米短体线虫(pz)和tylenchorhynchusannulatus(ta)；23-24为阴性对照。.

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市售，所用测试线虫本申请人实验室均有保存，可以免费向公众发放。

主要试剂：taqdna聚合酶购自天根公司；dnamarker购自takara公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pgem-teasyvector购于美国promegaprok(蛋白酶k)购自roche公司；bstdna聚合酶大片段购自newenglandbiolabs公司；sybrgreeni购自invitrogen公司。

实施例1旱稻孢囊线虫dna的提取、its扩增及序列分析

1.1旱稻孢囊线虫dna的提取

挑取单个旱稻孢囊放入装有10μlddh2o的0.2ml离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用无菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μl的10倍pcr缓冲液，2μl的600μg/ml蛋白酶k溶液，然后在-80℃下冷冻30min。将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫dna模板直接用于lamp和pcr反应。

1.2旱稻孢囊线虫its片段扩增及序列分析

应用its通用引物tw81和ab28扩增旱稻孢囊线虫its片段。pcr扩增反应体系为50μl，pcr反应体系为10×buffer(含mg²⁺)5μl，10mmdntp4μl，引物tw81和ab28(10μmol/l)各1μl，taq酶(5u/μl,takara)0.5μl，模板dna5μl，灭菌ddh2o补足至50μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。pcr扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，eb染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。

实施例2旱稻孢囊线虫lamp检测的建立

2.1lamp引物设计

根据旱稻孢囊线虫its区域特异性片段的测序结果，设计并筛选下述lamp引物(见图1)，引物交上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

1)he-f3:5’gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3:5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb5’-aggttggagctgggatgcg-3’

2.2lamp反应体系配置：

外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，内引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,环引物he-lb为0.4μmol/l；反应混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgs04,10mmol/l(nh4)2s04,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；1μldna模板；加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

2.3lamp反应扩增条件：将以上混合液置于65℃恒温水浴中等温扩增45min，85℃保温10min，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后观察结果(图2-a)。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，eb染色，在紫外灯下观测并照相，可看到有lamp的特征性梯形带(图2-b)，加入探针杂交后，插入lfd试纸，发现同时存在测试带和控制带(图2-c)。

实施例3旱稻孢囊线虫lamp灵敏度检测

将单头旱稻普孢囊dna模板按10倍稀释成1～1.0×10^-76个浓度，各取1μldna做模板，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按2.3反应条件进行，反应结束后，取3μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，eb染色，在紫外灯下观测并照相(图4-a)，在2-5泳道均观察到lamp的特征性梯形带，说明dna稀释1000倍后，仍能够检测，检测灵敏度为1/20000头线虫。同时以上述稀释dna为模板，以外侧引物f3和b3为引物，进行常规pcr检测，体系如下：2.5μl10×pcrbuffer(含mg²⁺)，2.5μl10mmdntps，1μlf3和b3(10um)，0.3μltaqdna聚合酶(5u/ul)，1μl模板dna，灭菌ddh2o补足至25μl，采用无线虫dna模板为阴性对照。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，52℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。pcr扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，eb染色后，凝胶电泳观察结果(图4-b)。结果表明在dna稀释到10^-2倍时，能够观察到扩增条带，10^-3和更低的浓度时常规pcr则不能检测。

以上结果说明：上述lamp检测体系能够检测到1/20000头旱稻孢囊线虫，比常规pcr检测灵敏10倍，具有极高的灵敏度。

实施例4旱稻孢囊线虫lamp特异性检测

收集旱稻孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫、潜根线虫短体线虫等22个种群(见表1)，分别提取其dna作为模板与旱稻孢囊线虫dna模板一起进行lamp检测，以检测旱稻孢囊线虫lamp检测方法的特异性。

表1供试的其它植物线虫群体样品代码及来源

上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板dna，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化。结果表明1-7管为旱稻孢囊线虫dna，可以观察到绿色荧光，其他植物线虫和阴性对照为模板的反应均为红褐色(图4)。结果表明上述lamp引物和反应体系能够特异性的检测旱稻孢囊线虫。

sequencelisting

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种旱稻孢囊线虫lamp快速检测方法

<130>pp17088－zwb

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>he-f3序列

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<212>dna

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<400>6

cgccgaggttggagctgggatgc23