1.一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒,其特征在于,包括:PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子;所述探针包括杂交探针和内标探针;
所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物;
所述引物的序列为:SEQ ID NO:1-37;
所述探针的序列为SEQ ID NO:38-55。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,每条所述杂交探针的5’末端都经过氨基与多聚polyT修饰。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,每条所述杂交探针的5’端oligodT的C6位置进行氨基化修饰。
4.一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法,其特征在于,包括:
筛选出16种呼吸道病原体的保守区域,分别得到16对引物,在所述16种呼吸道病原体的保守区域设计出16条杂交探针;
选取方形尼龙膜,使用10%EDC活化1h,将所述16条杂交探针、1种DNA内标探针、1种RNA内标探针点在尼龙膜上,探针排列为3×6矩阵,点与点之间的间距为100μm,得到杂交盒;
配置检测试剂盒,设置PCR反应扩增的程序,进行扩增反应,得到扩增产物;
向所述扩增产物中加入0.2mol的NaOH 50uL,得到变性后的扩增产物;
在杂交盒每孔内加入500uL预杂交液,15min后取出在杂交盒中预杂交液,在杂交盒每孔内加入杂交液400uL,同时相应的加入所述变性后的扩增产物100uL,将杂交盒放入55℃烘箱中,30min后取出移出孔内的杂交液;在杂交盒每孔内加入500ul杂交洗液1清洗3min,移出杂交洗液1;在杂交盒每孔内加入300ul酶标溶液,置于37℃烘箱中,30min后移出酶标溶液;在杂交盒每孔内加入500uL杂交洗液1,震荡清洗3min,用500uL杂交洗液2,震荡清洗3min;在杂交盒每孔内加入400ul显色液,室温显色1-2min,移出显色液,用杂交洗液2清洗每孔,用Bio-rad显影,得到杂交显色结果;
将所述杂交显色结果与标准卡进行对比,得出检测结果;
所述杂交洗液1为2x SSC与0.1%十二烷基硫酸钠溶液的混合溶液;所述杂交洗液2为0.5x SSC与0.1%十二烷基硫酸钠溶液的混合液溶液。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述PCR反应扩增的程序为:
逆转录,逆转录的温度为50℃,时间为30min;
cDNA预变性,预变性的温度为90℃-105℃,时间为1-10min,
变性,变性的温度为90℃-105℃,时间为10s-30s;
退火,退火的温度为40℃-65℃,时间为10s-60s;
延伸,延伸温度为40℃-80℃,时间为10s-5min。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述PCR反应扩增的程序为:
所述逆转录的温度为50℃,时间为30min;
所述预变性的温度为95℃,时间为2min,
所述变性的温度为95℃,时间为15s;
所述退火的温度为57℃,时间为20s;
延伸温度为72℃,时间为45s。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述酶标溶液为链霉亲和素和酶标母液的混合液;按照链霉亲和素:酶标母液=1:200配制。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述显色液为2mg/ml TMB:显色缓冲液:30%H2O2=500:500:1。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法,其特征在于,所述预杂交液、所述杂交液、所述杂交洗液1,所述杂交洗液2和所述酶标溶液使用前在55℃烘箱中预热30min。