白，有多种不同类型，常见的是I型，为酸溶性胶原蛋白。胶原蛋白具有良好的生物相容性、极低的免疫原性、良好的生物可降解性和一定的机械强度，在人类组织工程中是一种良好的组织支架材料。目前商品化的胶原蛋白有各种来源，例如自各种陆生动物如鼠、牛、猪、羊、鸡等，或者水生脊椎动物草鱼等及无脊椎动物鱿鱼、海参等，大多用作保健品，少量用于组织支架工程研究。我们以目前最主要的淡水珍珠育珠贝一一三角帆蚌进行试验，鼠源I型胶原蛋白、牛肌腱胶原蛋白、鱼鳞胶原蛋白以及自三角帆蚌组织提取的胶原蛋白在三角帆蚌体内都可以很好地降解。
[0013]五、制备含外套膜表皮细胞高分子水凝胶的方法:将生物可降解高分子材料溶解于细胞培养液或PBS中配成合适的浓度，将外套膜细胞在其中混匀，使高分子材料在外套膜细胞可以生存的温度、pH范围内成胶。以本发明优选的高分子材料胶原蛋白为例，其基本方法为:将胶原蛋白溶于酸溶液中，然后与预冷至4°C左右的细胞培养液或PBS混匀，调节pH至7.0左右，再加入预冷的外套膜细胞悬液混匀，立即灌注入模具中，放置于20?37°C条件下30?60分钟左右即可成胶。胶原蛋白成胶终浓度一般配成终浓度1?2mg/mL。为使外套膜细胞更好生长，配制水凝胶时可加入一些蚌血清或细胞生长因子或牛血清。不同高分子材料成胶的方法不同，可通过改变溶液的pH值、盐浓度、温度及加入交联剂等方式来实现，这些技术是高分子材料研究领域人员熟知的技术，通过简单的试验即可实现等同替代。
[0014]六、将含水凝胶层的珍珠核脱模，无菌包装，4?10°C可保存7?10天，37°C可保存1?2天，以尽快使用为佳。
[0015]本发明的有益效果:
[0016]采用本发明的方法，解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的因表皮细胞在珍珠核周围分布不均匀，导致异形珠大量产生的问题，采用本方法珍珠表面珍珠质均匀，基本都是正圆形优质珍珠。也使得珍珠核与育珠蚌的相容性提高，极少出现吐核。可以大大提高养殖的经济效益。直接将细胞混合在支架中，也方便了珍珠养殖场的使用。此外通过提取蚌肉中的胶原蛋白来作为高分子凝胶原料，也使传统珍珠生产中取珠后废弃的蚌肉有了新的用途，提高了珍珠养殖场的经济效益。
【附图说明】
[0017]图1是本发明实施例1所述的模具I一个半球的结构图。
[0018]图2是模具I半球的横切面图(与注胶孔所在位置垂直的面)，中间的虚线圆表示以后将放入的珍珠核。
[0019]图3是模具I两半球合拢后的俯视图(示注胶孔)。
[0020]图4是制备好的水凝胶珍珠核的切面图。
[0021]图5是本发明实施例2所述模具半球结构图。
[0022]图6是实施例2所述模具半球内部结构的俯视图。
[0023]图7是实施例1中用模具I制备的有4个凹槽的水凝胶珍珠核的横切面图。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例结合附图用对本发明的技术方案做进一步说明，但并不因此而限定本发明的保护范围。
[0025]实施例1
[0026]1.将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01被％的多聚赖氨酸溶液中浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。
[0027]2.制备珍珠核水凝胶层模具:采用二次成型法。模具I由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的球体。每个半球的内侧面有3条南北极(以注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极)方向排列的条状突起(以下简称棱)，其中2条棱分别位于半球两侧边缘(以下称边缘棱3)，另一条棱位于半球的正中间(以下称中间棱2)(图1，图2)，棱的长度为球体周长的1/2，因此3条棱的末端在球的南北极处相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；中间棱2的宽度3mm左右，高度1mm左右，边缘棱3宽度为中间棱的一半。模具II由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球内径为2倍棱高度与珍珠核直径之和，两半球合拢后一端球面处留有一注胶孔1用于灌注水凝胶溶液(图3)。使用时，模具I用于完成珍珠核水凝胶层制备的第一步，得到有4道凹槽9的含水凝胶层10的珍珠核(图7);模具II用于完成凹槽的填补，将用模具I制备的有凹槽的水凝胶珍珠核放入模具II，注入胶液，使凹槽被胶液填满，凝固后得到厚度基本均匀的球形水凝胶珍珠核。
[0028]3.获取游离外套膜细胞:清洗蚌壳，割断闭壳肌，取外套膜组织，去除或不去除内表皮，先用PBS缓冲溶液清洗3遍，将组织置于含4000?5000U/mL抗生素(青霉素+链霉素)的PBS缓冲溶液中浸泡10分钟，再PBS缓冲溶液(5分钟)一70vol %酒精溶液中迅速拉过一PBS缓冲溶液(10分钟)，放入培养皿，将组织剪碎成约1mm2小片，加入含EDTA的0.25wt%胰蛋白酶消化30分钟，然后加入含10vol%胎牛血清的RPM1640培养液，终止酶消化反应，用200目絹网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心5分钟，弃上清，加入含10vol%胎牛血清的RPM1640培养液吹散沉淀，使细胞悬液密度在5 X 107个细胞/mL左右，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞。置冰浴下备用。
[0029]4.珍珠核水凝胶层的制备:将鼠源I型胶原蛋白溶解于0.1M的乙酸溶液中，配成4.0mg/mL的浓度，将4体积鼠源I型胶原蛋白溶液与1体积5XRPM1640培养液在4°C下混合，用0.1M的NaOH调节pH至7.2左右，加入约5体积的冰浴预冷的细胞悬液，混匀，将珍珠核8置入模具I中(图2)，具体方法为，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球合拢成一个球体，一端的球面是封闭的，另一端球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注水凝胶溶液，此端的棱略短，留出孔道使凝胶溶液能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。待胶液处于半凝固状态时迅速将细胞凝胶预混液灌注入模具I中，室温或37°C放置30分钟左右即可完成凝胶过程。打开模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的含水凝胶层珍珠核；再将其注胶孔处的凝胶挖去少量，形成一个连通4道凹槽的凹口，放置入模具II中，使凹口处对准注胶孔，再灌注细胞凝胶预混液，室温或37°C放置30分钟左右使凹槽中的胶液凝胶，这样就在珍珠核5周围形成了均匀分布有外套膜细胞的水凝胶层4(图4)。将水凝胶珍珠核脱模，无菌包装，低温下(4?10°C )储存，迅速运至养殖场进行植核。
[0030]实施例2
[0031]1.将打磨好的珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt%的多聚赖氨酸溶液中振荡浸泡30分钟，取出，无菌条件下晾干。
[0032]2.制备珍珠核水凝胶层层模具:采用一次成型法。模具由两个半球构成(图5，图6)，每个半球的内侧面有3根与半球的平面垂直的细柱7，处于彼此相隔120°的位置，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使水凝胶层厚度均匀，与半球的平面垂直是便于脱模时不损伤水凝胶层。细柱的长度在1.2mm左右，两半球合拢后球面留有一小孔6用于灌注水凝胶溶液。当灌入的水凝胶细胞混悬液交联凝结成凝胶后脱模。由于移植到育珠蚌体内后，凝胶中的高分子材料在蚌体内会逐渐降解，细胞也会自动迀移，凝胶中支撑柱留下的小孔不会影响将来植核后外套膜表皮细胞在珍珠核周围的均勾分布。
[0033]3.游离外套膜细胞的获取:同实施例1。
[0034]4.珍珠核水凝胶层的制备:细胞凝胶混悬液的制备方法同实施例1。先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，将预冷的细胞凝胶混悬液从注胶孔灌注入模具中，室温或37°C放置30分钟左右使胶液凝结，打开模具取出珍珠核，无菌包装，低温下(4?10°C )储存，迅速运至养殖场进行植核。
[0035]实施例3:以贝类动物的胶原蛋白作为高分子水凝胶原料。
[0036]1.制备三角帆蚌胶原蛋白:
[0037]⑴将取珠后的三角帆蚌去除内脏团，洗净，吸干水分，剪成小