0 μ L(浓度为6. 9mg/mL)，MYO L 0 μ L(浓度为 7.8mg/mL)，HFABP1.5yL(浓度为 4.8mg/mL);恒温混匀仪 25°C，300r/min，振荡 Ih ;各加 入3yL100ymol/LDNA探针1，充分混匀4°C静置12h ;9000r/min，离心50min，移去上清； 100 μ L胶体金重悬液重悬，4°C保存备用。
[0026] (3)信号探针制备：取 ImL 15nm AuNPs，9000r/min，离心 50min，弃上清；取 3 μ L 100 μ mol/L DNA探针2,加入97 μ L去离子水补足至100 μ L重悬纳米金，4°C静置12h ;分3 次加入 〇· lmol/L PB (pH = 7. 4)和 lmol/L NaCl 至终浓度分别为 10mmol/L、0. lmmol/L，每 次间隔2h，充分混匀4°C静置48h ;用PB/NaCl混合液（PB、NaCl、H20比例为1:1:8)将上述 液体补足至ImL ;9000r/min，离心50min，移去上清；加入100 μ LPB/NaCl混合液重悬，4°C 保存备用。
[0027] (4)反应流程：1% BSA封闭芯片5min后氮气吹干；将待检样本15 μ L、检测探针 12yL、杂交液12yL和信号探针6yL混匀后加入芯片，分子杂交仪中37°C孵育30min ; PBST 洗液洗 2 次，各 30s，氮气吹干；将 25mmol/L MES(pH = 6. 0)、30% !1202和 0. lmol/L 四 氯金酸按体积比5:3:2加入方阵中染色5min，去离子水冲洗终止反应（整个过程在暗盒中 进行），检测过程及原理如图1所示。
[0028] 结果观察分析用显微镜对结果进行观察分析，阳性表现为黑褐色点出现，根据待 检样本浓度不同，灰度不一。阴性结果为空白（羊抗鼠抗体IgG结果除外）。通过Gray analysis 5. 0软件对结果进行灰度值测定从而实现对待检样本的定量分析。
[0029] 统计学处理：
[0030] 采用SPSS17. 0软件进行数据处理及统计学分析，计数资料比较采用X2检验。以 α = 0. 05为检验水准，P〈0. 05表示差异有显著性。
[0031] 纳米金探针标记结果表征：
[0032] 蛋白质的氨基酸残基与胶体金表面配体（羧基）通过静电及氢键作用使其很容易 吸附到胶体金表面形成稳定的核壳结构。巯基修饰的DNA探针通过Au-S键高效率组装到 纳米金表面经杂交使信号放大。大量文献研宄表明紫外吸收光谱分析广泛应用于纳米金生 物分子标记技术中，可用来表征纳米金颗粒的大小及分散性。本实施例中检测探针共三种， 分别标记HFABP、cTnl、MYO相应检测抗体和DNA探针1，信号探针标记有DNA探针2。用紫 外分光光度仪分别测试标记前后的吸收光谱如图2所示，纳米金原液最大吸收峰对应波长 在518nm处，而标记抗体、DNA探针后的纳米金颗粒直径增大，紫外可见吸收光谱最大吸收 峰向长波段红移了 7nm为525nm。电泳表征纳米金探针标记结果如图3所示，由于三种蛋白 分子量不同（HFABP15kDa、cTnI23. 5kDa、MY0 18kDa)导致迀移速率不等（HFABP最快，MYO 次之，cTnl最慢）；纳米金原液由于电泳液中盐离子作用发生聚集而沉积在加样孔中。综上 所述，纳米金探针标记成功。
[0033] 纳米金探针加入量优化：
[0034] 平行做8组实验，将信号探针的加入量固定为4 μ L，3种蛋白检测探针各自的加入 量分别设为1 μ L、2 μ L、3 μ L、4 μ L、5 μ L、6 μ L、7 μ L、8 μ L共8个反应体系。如图4所示， HFABP、MYO检测探针加入量在1 μ L~4 μ L时，随着检测探针加入量的增加检测信号（灰 度值）不断增加，4 μ L时信号最强，4 μ L以后检测信号开始下降，同时背景信号及非特异性 信号增强。cTnl检测探针加入量在1 μ L~3 μ L时，随着加入量的增加信号不断增加，3 μ L 时信号最强，大于3 μ L检测信号开始减弱，背景信号及非特异信号开始增强。然后分别固 定3种蛋白检测探针的最佳加入量，重新设8组平行试验，调整信号探针的加入量从1 μ L 依次增至8 μ L，同理可得出信号探针的最佳加入量为6 μ L。
[0035] 探针杂交放大前后结果对比：
[0036] 分别构建芯片上单独标记抗体的单一纳米金反应与在此基础上通过双纳米金杂 交放大体系，两者结果对比如图5所示，单纳米金反应时3种蛋白标准品浓度在Ing/mL时 检测信号不明显，与空白对照结果无明显差别。双纳米金探针杂交体系在Ing/mL时检测信 号较前者明显增强，后者3种蛋白标准品浓度在32ng/mL时的检测信号远远大于前者。可 见本实施例构建的基于双纳米金探针杂交的蛋白芯片技术较前者相比极大提高了同一浓 度反应检测的灵敏度。
[0037] 蛋白芯片标志物特异性检测：
[0038] 平行做4组实验，其中HFABP、MYO检测探针各3 μ L、cTnl检测探针4 μ L、信号探 针6 μ L加入分液管中，共4管。然后往每个管中分别加入PBS、HFABP、cTnl、MYO标准品各 15 μ L，混匀后移入芯片的四个方阵，37°C分子杂交仪中孵育30min，染色后终止反应观察 结果如图6所示。图左侧一列点有羊抗鼠 IgG抗体作为阳性参照，第1排、第2排、第3排 分别点有HFABP、cTnl、MYO捕获抗体。图6 (A)加入样品为PBS，作为空白对照组无明显检 测信号。图6(B)加入样品为HFABP抗原标准品，第1排检测信号明显，余2排无明显检测 信号（阴性对照）。图6(C)加入样品为cTnl抗原标准品，第2排检测信号明显，余2排无 明显检测信号。图6(D)加入样品为MYO抗原标准品，第3排检测信号明显，余2排无明显 检测信号。综上可得各蛋白之间无交叉反应，特异性良好。
[0039] 绘制标准曲线：
[0040] 该方法检测HFABP、cTnI、MY0抗原标准品后绘制的标准曲线见图7, HFABP浓度在 10pg/mL ~165ng/mL 间拟合曲线关系良好 R2= 0· 995 ;cTnI 浓度在 10pg/mL ~330ng/mL 之间拟合曲线关系良好，R2= 〇. 994 ;ΜΥ0浓度在640pg/mL~1300ng/mL之间拟合曲线关 系良好，R2= 0. 990。
[0041] 灵敏度检测：将3种蛋白抗原标准品从10 μ g/mL开始进行等比稀释，然后分别对 不同浓度的标准品进行检测。随着抗原标准品浓度的降低，显色后各方阵灰度逐渐减弱。 HFABP、cTnl抗原标准品浓度在10pg/mL以下时检测结果与空白对照无明显差别，MYO抗原 标准品浓度在640pg/mL以下时检测结果与空白对照无明显差别，即HFABP、cTnl灵敏度为 10pg/mL，MY0 为 640pg/mL，与临床 ECLIA 法（cTnl 20pg/mL，MY0 21ng/mL)以及 ELISA 法 (HFABP360pg/mL)相比，cTnl检测灵敏度相当，其余2种蛋白检测灵敏度大大提高。标准曲 线建立后，未知样本通过本体系反应所得灰度值代入曲线即可求出该样本浓度。一个反应 玻片可预先设置多个方阵，即可同时检测多个样本。每个方阵中可预点几种蛋白（每种蛋 白点一横列），即可检测同一样本中的不同成分。每一横列重复点样6次，最后求6个点的 平均灰度值，大大提高了所得结果的准确性、时效性。
[0042] 不同检测方法样本检测结果对比：
[0043] 本方法检测血清102例，其中急性心肌梗死42例，不稳定性心绞痛30例，正常体 检者30例，三组检测结果分别与ECLIA及ELISA试剂盒（HFABP)比较（表2,表3)，cTnl敏 感性为 73. 81%、MY088. 10%、HFABP92. 86%。cTnl 与 MYO 联合检测敏感性为 89. 05%，cTnI 与HFABP联合检测敏感性为93. 10 %，三者同时检测敏感性为93. 56 %，该体系与ECLIA及 ELISA检测结果整体一致（P>0. 05)。
[0044] 表 2
【主权项】
1. 一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在于：由含有捕获抗体的蛋 白芯片、标记检测抗体和DNA探针1的检测探针以及标有DNA探针2的彳目号探针组成；其 中，所述捕获抗体、检测抗体为TnI、MYO、HFABP相应的捕获抗体、检测抗体，DNA探针1的序 列为5'-511-(012)31'1'1'1'1'1'1'1'11^0六0六66六60六六0六6-3'，0嫩探针2的序列为5'-511-(012)3丁 TTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC-3'。
2. 根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在 于：所述蛋白芯片的制备方法为：将cTnI、MYO、HFABP捕获抗体及羊抗鼠IgG抗体与蛋白点 样液混合，通过芯片点样仪点样；点样完毕后将芯片晾干，经微阵列稳定液处理固定，干燥 后真空包装保存备用。
3. 根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在 于：所述检测探针的制备方法为：取AuNPs，用K2CO3调整pH;依次加入cTnl检测抗体、MYO 检测抗体、HFABP检测抗体；恒温振荡，然后加入DNA探针1，充分混匀，离心、重悬，保存备 用。
4. 根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在 于：所述信号探针的制备方法为：取AuNPs，离心，取DNA探针2,加入去离子水重悬纳米金， 静置，加入PB和NaCl，充分混匀静置；再加入PB/NaCl混合液离心，加入PB/NaCl混合液重 悬，保存备用。
5. 根据权利要求1所述的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，其特征在 于：所述信号探针使用时的加入量为6yL。
【专利摘要】本发明涉及一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，由含有捕获抗体的蛋白芯片、标记检测抗体和DNA探针1的检测探针以及标有DNA探针2的信号探针组成。本发明40min内可对多种蛋白进行高灵敏联合检测，敏感快捷、成本低、小型化、不需要复杂的光学组件、所用样本量极少，在生物医学及化学分析等方面均有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104792999
【申请号】CN201510131861
【发明人】毛红菊, 黄丽君, 薛德明, 张丽华, 白亚楠, 刘慧颖, 贾春平, 金庆辉, 赵建龙
【申请人】中国科学院上海微系统与信息技术研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月24日