用于黄瓜‘粤青1号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法与流程

本发明属于分子标记检测领域，具体涉及一种用于黄瓜‘粤青1号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。

背景技术：

种子质量是农业生产中的重要元素，其质量的优劣程度直接影响农产品的质量和产量。品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法从农业生产角度具有稳定可靠的优点，但从遗传学角度看，品种的纯度和真伪鉴定是实质上是对品质基因型的鉴定，只有通过鉴定DNA分子本身才能准确可靠的鉴定品种的基因型。传统的品种纯度鉴定方法时间跨度大，容易受环境和人为因素的影响，效率低。

黄瓜是世界上重要的蔬菜作物。有限的亲本资源以及杂交品种的不断涌现,使得品种间尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小,蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之黄瓜为自花授粉作物，人工去雄不及时，常会出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大损失。

“粤青1号”黄瓜是以YC-5为母本，B11为父本育成的华北型黄瓜一代杂种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的品种。为了保证优良品种发产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可用于快速鉴定黄瓜‘粤青1号’杂交种子纯度的引物及方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于黄瓜‘粤青1号’杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其可以在黄瓜‘粤青1号’杂交种子中扩增出189 bp的母本特异标记，226 bp的父本特异标记。

所述母本特异标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，父本特异标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述SSR引物的核苷酸序列如下所示：

85F: 5’-TCACACCTGCATTTTTCATCA-3’（SEQ ID NO .1）；

85R: 5’-GAGGCGTTCTCAACATACCC-3’（SEQ ID NO.2）。

黄瓜‘粤青1号’杂交种子纯度的鉴定方法，包括如下步骤：

（1）提取黄瓜幼苗基因组DNA；

（2）以黄瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1-3任一项所述的SSR引物进行PCR扩增；

（3）对扩增的产物进行凝胶电泳；

（4）对电泳结果进行分析，只有同时具有母本和父本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物产生189 bp的母本特异标记， 226 bp的父本特异标记。

PCR扩增的20μl反应体系为：基因组DNA 5ng，10×buffer（+Mg²⁺)2μl，dNTP 0.2mmol·L^-1，SSR引物0.25 mmol·L^-1，Taq 酶0.2U。

PCR扩增的程序为：94℃预变性5min后，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。

所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明的有益效果是：

本发明的方法可将‘粤青1号’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

附图说明

图1为SSR引物对黄瓜‘粤青1号’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（YC-5：母本；B11：父本；F1-1--F1-4：杂交一代种子）；

图2为46株‘粤青1号’杂交种子的检测结果，准确率为100%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 杂交黄瓜‘粤青1号’种子纯度检测方法的建立。

1、筛选纯度鉴定的SSR引物。

从所公布的黄瓜SSR引物在亲间进行筛选，选出共显性差异标记条带的85号引物，其序列如下所示：

85F: 3’-TCACACCTGCATTTTTCATCA-5’(SEQ ID NO.1)；

85R: 3’-GAGGCGTTCTCAACATACCC-5’ (SEQ ID NO.2).

两种标记带型清晰、重复性好。引物能产生的母本特异性标记和的父本特异性标记。

2、利用上述特异性引物对杂交黄瓜‘粤青1号’种子进行纯度鉴定。

（1）黄瓜DNA的提取

实验材料为黄瓜‘粤青1号’商品种及其母本YC-5、父本B11子叶DNA。步骤如下：

①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μl 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min（每隔5min摇动一次）。

②静置至室温后在4℃下12000rpm离心10min，将上清（约800μl）转移到新的2ml 离心管。

③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml 离心管中。

④加2/3体积340μl预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次），置于－20℃下培养30min。

⑤在4℃下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μl预冷的 70%乙醇洗涤DNA沉淀（两次），微干。

⑥加入100μl无菌水溶解。

（2）SSR-PCR 扩增：

PCR体系（20μl）

DNA模板：5ng

引物-F：0.25 mmol·L^-1

引物-R：0.25 mmol·L^-1

dNTP：0.2mmol·L^-1

10×PCR(Mg²⁺) buffer：2.0μl

Taq酶：0.2U

ddH₂0补足至20μl

PCR扩增程序

94℃预变性5min后，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保持7min，然后置于20℃保存待检测。

（3）凝胶电泳

扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1%AgNO₃银染15min；银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na₂CO₃显色，显色后在灯箱上拍照分析。

（4）扩增结果

85号引物在黄瓜‘粤青1号’母本中扩增出a条带，在父本中扩增出b条带，在黄瓜‘粤青1号’杂交一代种子扩增出两条特异条带(见图1）。

回收特异条带，送英俊公司测序。a条带的序列如SEQ ID NO.3所示，b条带的序列如SEQ ID NO.4所示。杂交种子中与父本、母本扩增产物的序列相符。

实施例2

采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的46株‘粤青1号’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测（见图2），检测结果两个引物检测结果一致，种子纯度为100%，与田间调查结果一致，准确率为100%。

以上实施例表明，本发明的方法可将‘粤青1号’杂交种子与其父母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 用于黄瓜'粤青1号'杂交种子纯度鉴定的引物及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcacacctgc atttttcatc a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggcgttct caacataccc 20

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 3

gaaaagcatt gatatgagta tgatatgaat atgaatatga atatgaatat gaacatgaac 60

atgaacatga gtagagagtt tcattgtttt atctgatcat ttgcttcaac cttacctatc 120

ttgatatatg ctaaatatgc cattggcatg gattagatca tacgttcttg ggtatgttga 180

gaacgcctc 189

<210> 4

<211> 226

<212> DNA

<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 4

caaaagcatt gaatatgagt atgatatgaa tatgaatatg aatatgaata tgaatatgaa 60

tatgaatatg aatatgaata tgaacatgaa catgaacatg aacatgagta gagagtttca 120

ttgttttatc tgatcatttg cttcaacctt acctatcttg atatatgcta aatatgccat 180

tggcatggat tagatcatac gttcttgggt atgttgagaa cgcctc 226