技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及泸定百合抗百合镰刀菌枯萎病相关基因KTI的EST-PCR分子标记及其应用。
背景技术：
由百合尖孢镰刀菌专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）引起的百合镰刀菌枯萎病是目前百合生产中危害最为严重的病害。百合镰刀菌枯萎病（Lily FusariumWilt ）又称百合根腐病、茎腐病，该病不仅会造成百合切花产量下降，品质降低，还可侵染百合鳞茎基部，造成基盘坏死，鳞片腐烂、散落，种球质量下降，而镰刀菌是一种在许多作物上引起严重病害的土传真菌，很难进行有效控制。利用抗镰刀菌枯萎病百合种质资源，筛选发掘抗病基因，培育抗病品种是防治百合镰刀菌枯萎病最经济有效的方法。
不同的百合品系（品种或资源）对百合镰刀菌枯萎病的抗性表现不一样，亚洲百合杂交种（系）对镰刀菌有较强的抗性，部分中国野生百合和LA系百合也表现较好的抗性，而东方百合的抗性最差。有研究者利用一些如RAPD、AFLP等分子标记对亚洲百合的镰刀菌病害抗性进行了分析。
泸定百合（Lilium sargentiae Wilson），为中国特有，花型优美，花色洁白并具芳香，且适应性好，抗性强，尤其表现在对百合镰刀菌枯萎病的抗性方面，泸定百合不仅是非常好的野生鲜切花材料，也是一些现代百合品种的重要育种亲本以及百合育种中重要的优良基因供体材料。
我们通过构建百合镰刀菌诱导的泸定百合SSH文库，从文库中筛选到一个Kunitz 型丝氨酸胰蛋白酶抑制剂（KTI）基因EST，根据该EST序列，开发了一对EST-PCR分子标记引物，该分子标记不仅可对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗/感性的百合资源进行抗性鉴定。还可以对包括野生百合、东方百合品系、亚洲百合品系及LA百合品系中的一些百合资源进行品系鉴定区分，该分子标记引物将为抗病育种及百合杂交育种过程中亲本材料的选择供一定帮助。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一对来自于泸定百合（Lilium sargentiae Wilson）百合镰刀菌枯萎病抗性相关基因Kunitz型丝氨酸胰蛋白酶抑制剂（KTI）基因的EST-PCR分子标记引物，该分子标记在分子水平上不仅可对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗/感性的百合资源（品种）进行鉴定，还可对包括野生百合、东方百合品系、亚洲百合品系及LA百合品系中的一些百合资源进行品系鉴定区分。该分子标记引物将为抗病育种及百合杂交育种过程中亲本材料的选择供一定帮助。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
泸定百合抗百合镰刀菌枯萎病相关基因KTI的EST-PCR分子标记，所述的KTI基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记引物选自下列引物对：
正向引物：5’-agatgtctgtggtgctg-3’ （SEQ ID NO.2），
反向引物：5’-gatttccgttgagtgtc-3’ （SEQ ID NO.3）。
本发明还提供上述泸定百合抗百合镰刀菌枯萎病相关基因KTI的EST-PCR分子标记在百合镰刀菌枯萎病抗性鉴定中的应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明公开了一对来自于泸定百合（Lilium sargentiae Wilson）抗百合镰刀菌枯萎病相关基因Kunitz型丝氨酸胰蛋白酶抑制剂（KTI）基因的EST-PCR分子标记引物，为首次报道的与抗百合镰刀菌枯萎病相关的百合EST-PCR分子标记。该分子标记在分子水平上不仅可对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗/感性的百合资源（品种）进行鉴定，还可对包括野生百合、东方百合品系、亚洲百合品系及LA百合品系中的一些百合资源进行品系鉴定区分，根据扩增条带，可以将百合资源归类，比如是东方百合，还是亚洲百合，还是LA品系或野生百合。该分子标记引物将为抗病育种及百合杂交育种过程中亲本材料的选择供一定帮助。
2、相比前人开发的与抗百合镰刀菌枯萎病相关的其它分子标记如RAPD、DArT、AFLP 和NBS profiling等分子标记（这些分子标记仅适用于部分亚洲百合品系），该EST-PCR分子标记具有以下优势：可以对包括野生百合、亚洲百合、东方百合及LA百合等多种百合品系进行鉴定；不仅可以对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗性的百合资源进行抗性鉴定，还可以在一定程度上对不同百合品系进行鉴定区别；可以直接对不同百合种资资源进行百合镰刀菌枯萎病抗性鉴定，不需要构建百合抗/感病杂交后代群体，省去构建百合抗/感病杂交后代群体的繁琐工作程序；该分子标记来自EST，保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记（如SSR标记）更高，更适用于远缘物种间的比较研究；EST-PCR分子标记引物开发简单、快捷、费用低；
3、该分子标记除了可对不同百合资源进行抗病或感病鉴定及品系鉴定分类外，该分子标记PCR扩增结果显示泸定百合（图中编号为ld）与岷江百合(图中编号为mj)扩增条带完全一致，川百合（图中编号为c）、亚洲百合（图中编号第一个字母为Y者）和LA品系（图中编号第一个字母编号为L者）等其它百合的扩增条带一致，这在一定程度上证明泸定百合和岷江百合二者亲缘关系更关，这与前人的研究结论一致。而川百合、LA品系百合和亚洲百合之间亲缘关系较近，也同前人的研究结果相一致。
附图说明
图1是用KTI基因EST-PCR分子标记引物在23个不同品系百合中的扩增结果，M为DL 2000 Marker，水为阴性对照，其余代号见表1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
泸定百合（公知公用材料，姜福星，杨丽娟等 泸定百合转录组测序与特性分析 西北林学院学报 Journal of Northwest Forestry University 2015, 30(5): 143-150）组培苗经行镰刀菌诱导后进行百合镰刀菌诱导后构建SSH文库（杨嫦丽，王有国等，镰刀菌诱导的泸定百合SSH文库构建及抗病相关基因筛选西北植物学报 Acta Bot. Boreal.-Occident. Sin 2014,34(11):2170-2175）。
从SSH文库中随机筛选单克隆进行测序比对进行功能预测，根据测序比对结果从泸定百合经百合镰刀菌诱导的正向SSH文库中得到一个Kunitz型丝氨酸胰蛋白酶抑制剂（KTI）基因EST序列，该EST核苷酸序列为（下划线部分为分子标记引物位置）：catggtttatgatacctctggcaacacgctcaaacccggaactccctactacatcacatcagctatatggggcgctggcggtggcgggctcttcccccttagtcgcccaagaatctgccctagatgtctgtggtgctgccccctaaatgtggctcagaagtcgagcgacctcgacaaaggtctcccagtgtatttgtctccctccaactcgagcgaagaagtcgtgcatctcctcaccgacctcaaaatcgagttcaccactcctccccccgatggtgggtcgccaatatggaagctcgatagcgctgattccaacggccaacgatatgtgacactcaacggaaatccatttaacaccattgatgtgaaaaactggttcaagattgacaaagccgatgtatttggatacaaactgctatattgccccagtgtagccggcaaccttgccgatggtgcttgcggcagtctgggtatagagtacgaggatgggaaaaggtggttggttctgagcgacaacccgttctgggttgtctttgtcaaggcataacctctcatgggctcatgaaataagggcttttatgtctgagtgtttgctatgtgtaccagtgtgtggagtcccatggaataagagctttgtgcctttgggttagctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
根据所获得的候选抗病基因EST序列，利用Primer 5.0软件设计引物：
正向引物：5’-agatgtctgtggtgctg-3’ ，
反向引物：5’-gatttccgttgagtgtc-3’ 。
以23个对百合镰刀菌病害表现不同抗/感病性的百合资源（杨秀梅，王继华等，百合品种抗病基因同源序列分析及抗枯萎病的鉴定 园艺学报 Acta Horticulturae Sinica 2012, 39(12):2404–2412）的基因组DNA 2µL为模板对其进行PCR抗病分子鉴定。
由于市场上的不同品系百合品种太多，本研究仅选取了市场上比较常见的、流行的，且前人做过抗病鉴定的一些不同百合品系栽培品种及一些比较重要的野生百合资源等23个百合资源做为试验材料，如表1所示。
PCR反应体系：DNA 2µL；10µM的正向引物和10µM的反向引物各0.5µL；2.5µL 10×buffer；2.5µL 2.5mM的dNTP；1.5µL 25mM的Mg2+；0.25µL (5U/µL)Taq polymerase（TaKaRa）；加水至总体积为25µL。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 45 s，45℃ 45 s，72℃ 1min，33个循环；72℃延伸10min。
PCR产物经质量浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测拍照，如表1所示，切取明亮的扩增条带，回收后送交昆明硕擎公司测序鉴定，鉴定证明扩增条带就是KTI基因。
表1
表1中的23个百合资源对镰刀菌表现抗/感及抗/感强弱分级参考杨秀梅，王继华等，百合品种抗病基因同源序列分析及抗枯萎病的鉴定 园艺学报 Acta Horticulturae Sinica 2012, 39(12):2404–2412。
不同品系的鉴别区分：从图1中可以看到，包括野生百合、东方百合、亚洲百合和LA百合在内的4个不同百合系列，扩增条带有一定差别。亚洲百合品系在600bp左右（500bp和700bp之间）和900bp左右（700bp和1000bp之间）都有2条较明显的扩增条带，而LA百合品系除了具有这2条类似的扩增条带外，还在400bp左右（250bp和500bp之间）有一条很明显的扩增条带。东方百合品系的扩增条带完全不同于其它百合品系，仅在250bp上下，有2条较明显的扩增条带。而野生百合由于资源较多，地域差别较大，所以条带也不完全一样，但在一定程度上也可以区别与其它品系百合，从图1中可以看出，由于泸定百合(ld)与岷江百合（mj）进化关系较近，所以它们2个的扩增条带完全一样，在250bp和500bp左右各有一条较明显的扩增条带，而川百合（c）由于与亚洲百合及LA百合的遗传关系较近，所以它们的扩增较相似，但也有一定差别，就是川百合除了在600bp左右和900bp左右各有2条与亚洲百合品系和LA百合品系完全一样的扩增条带外，还在250bp左右有一条区别于亚洲百合品系和LA百合品系的扩增条带。而兰州百合（lz）的扩增条带完全区别于其它百合，仅在400bp左右具有一条类似于LA百合品系的400bp的明显条带。
抗病鉴定：结合图1，我们可以知道抗病百合的扩增条带明显区别于感病百合。感病百合的扩增条带都明显较小，扩增条带仅在250bp左右，且扩增条带较少，较弱。感病百合资源也都为东方百合品系，这也与文献报道相符。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
catggtttat gatacctctg gcaacacgct caaacccgga actccctact acatcacatc 60
agctatatgg ggcgctggcg gtggcgggct cttccccctt agtcgcccaa gaatctgccc 120
tagatgtctg tggtgctgcc ccctaaatgt ggctcagaag tcgagcgacc tcgacaaagg 180
tctcccagtg tatttgtctc cctccaactc gagcgaagaa gtcgtgcatc tcctcaccga 240
cctcaaaatc gagttcacca ctcctccccc cgatggtggg tcgccaatat ggaagctcga 300
tagcgctgat tccaacggcc aacgatatgt gacactcaac ggaaatccat ttaacaccat 360
tgatgtgaaa aactggttca agattgacaa agccgatgta tttggataca aactgctata 420
ttgccccagt gtagccggca accttgccga tggtgcttgc ggcagtctgg gtatagagta 480
cgaggatggg aaaaggtggt tggttctgag cgacaacccg ttctgggttg tctttgtcaa 540
ggcataacct ctcatgggct catgaaataa gggcttttat gtctgagtgt ttgctatgtg 600
taccagtgtg tggagtccca tggaataaga gctttgtgcc tttgggttag ctgaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 681
SEQ ID NO.2
agatgtctgt ggtgctg 17
SEQ ID NO.3
gatttccgtt gagtgtc 17