痰液中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的高效液相色谱‑串联质谱同时检测方法与流程

本发明属于仪器分析检测领域，涉及一种痰液中醋酸镰孢氨酸c(n,n',n"-triacetylfusarininec,tafc)和双甲硫基胶霉毒素(bis(methylthio)gliotoxin,bmgt)的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法。

背景技术：

曲霉菌是自然界中广泛存在的一种真菌，在相对温暖和湿润的环境中会较为快速的生长和繁殖。空气中弥散的真菌孢子可通过人体的呼吸进入呼吸道定植。为了深入了解曲霉菌在人群中的分布情况，国内、外研究者在不断探索呼吸道中是否有曲霉菌定植的方法。目前鉴定人体呼吸道内是否有曲霉菌定植的方法主要是痰液真菌培养，然而该方法敏感性很低而且培养周期很长。因此，目前有越来越多的研究在探索通过曲霉菌标志物的检测来判断呼吸道是否存在曲霉菌定植。

tafc是曲霉菌在缺铁环境下合成和释放的一种铁载体。bmgt是由曲霉菌合成和分泌的另一种化合物。目前，有文献报道使用高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)从血清中检测tafc的方法，也有研究者采用高效薄层色谱分析仪(hptlc)从血清中检测出bmgt的方法。然而，血清的检测存在敏感性较低的弊端，基于局部器官和组织的标本检测可能会能更好地反映曲霉菌在人体中特定部位的分布情况。痰液是呼吸道分泌物，因此痰液中曲霉菌相关标志物的检测可能更直接地反映呼吸道曲霉菌的定植。此外，现有方法尚无法实现tafc和bmgt这两种化合物的同时检测。因此，若能开发出从痰液中同时检测tafc和bmgt的方法，对于深入研究曲霉菌在人体呼吸道的分布与定植情况、丰富tafc和bmgt的检测途径、提高检测效率都将产生积极的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种痰液中tafc和bmgt的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，以丰富tafc和bmgt的检测途径，提高检测效率。

本发明提供的痰液中tafc和bmgt的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，步骤如下：

(1)标样和试样的制备

①将tafc和bmgt用甲醇溶解，并用乙腈稀释得到一系列tafc和bmgt浓度梯度变化的混合标准液；配制非那西丁溶液作为内标溶液；

②取等体积的各混合标准液，向各混合标准液中分别加入等体积的空白痰液样品和等体积的内标溶液，然后混匀得到一系列混合液，分别向各混合液中加入萃取剂萃取2～3次，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，在氮气保护下去除萃取剂，得一系列固态物质，将各固态物质分别用乙腈水溶液溶解并定容至同一体积，离心，所得一系列上清液即为标样；

③向待测痰液样品中加入内标溶液并混匀，再向所得含内标的痰液样品中加入萃取剂萃取2～3次，合并萃取液并在氮气保护下去除萃取剂，将所得固态物质用乙腈水溶液溶解，然后离心，所得上清液即为试样；

(2)标样和试样的测定

采用液相色谱-串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中tafc、bmgt和非那西丁的峰面积；

色谱条件：采用agilentextendc18色谱柱，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，流动相a为0.1wt％～0.15wt％的甲酸水溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相b的体积百分数为25％、流动相a的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相b的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相a的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min，洗脱液中流动相b的体积百分数为95％、流动相a的体积百分数为5％；

质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500～3550v，干燥气温度350～360℃，干燥气流速5～6l/min，鞘气温度350～360℃，鞘气流速11～12l/min，deltaemv300～320v；测定醋酸镰孢氨酸c的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240v，碰撞电压为65v；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76v，碰撞电压为5v；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为138.3，碎裂电压为120v，碰撞电压为15v；

(3)检测结果的获取

以各标样中tafc的浓度为横坐标，以各标样谱图中tafc与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制tafc的工作曲线；以各标样中bmgt的浓度为横坐标，以各标样谱图中bmgt与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制双甲硫基胶霉毒素的工作曲线；

将试样谱图中tafc与非那西丁的峰面积比值、bmgt与非那西丁的峰面积比值分别带入tafc和bmgt的工作曲线的线性回归方程中，计算出试样中tafc和bmgt的浓度。

上述方法中，所述萃取剂为氯仿或二氯甲烷。

上述方法方法的步骤(1)②中，每次萃取剂的加入量为含内标的混合工作液体积的3～4倍，步骤(1)③中，每次萃取剂的加入量为得到含内标的痰液样品体积的3～4倍。

上述方法中，所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分数为35％～50％。

上述方法中，将非那西丁用乙腈配制成非那西丁浓度为13～14ng/ml的溶液作为内标溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种从痰液中同时检测tafc和bmgt的方法，为tafc和bmgt的检测提供了新的途径，解决了现有方法无法实现tafc和bmgt同时检测的不足，有利于提高检测效率。

2.试验表明，本发明所述方法在1.56～100ng/ml浓度范围内对tafc和bmgt具有良好的线性，检测tafc和bmgt的日内、日间精密度相对标准偏差rsd不超过8％，符合小于15％的要求，准确度相对偏差re不超过±9％，符合不超过±15％范围的要求。

3.本发明所述方法采用常规试验仪器和试剂即可实现tafc和bmgt的检测，操作简单，有利于推广应用。

附图说明

图1是实施例1中1#标样的谱图；

图2是实施例1绘制的tafc的工作曲线；

图3是实施例1绘制的bmgt的工作曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明所述痰液中tafc和bmgt的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法作进一步说明。实施例中采用的仪器为agilent1260-6460型高效液相色谱质谱联用仪。

实施例1

本实施例中，对标样进行测试，以考察本发明所述方法的线性范围，步骤如下：

1.标样的制备

(1)准确称量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt浓度均为10mg/ml的混合储备液。

取混合储备液7份，用乙腈稀释得到1#～7#混合标准液，1#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为15.63ng/ml，2#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为31.25ng/ml，3#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为62.50ng/ml，4#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为125.00ng/ml，5#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为250.00ng/ml，6#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为500.00ng/ml，7#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为1000.00ng/ml。

(2)称取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁储备液，取适量非那西丁储备液用乙腈稀释得到内标溶液，该内标溶液中非那西丁的浓度为13.8ng/ml。

(3)取1#～7#混合标准液各10μl，分别向1#～7#混合标准液中加入100μl空白痰液(不含tafc和bmgt的痰液)和10μl内标溶液，涡旋混匀，得到7份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干并将所得固态物质乙腈体积百分数为50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后离心，所得上清液即为标样，依次记作1#标样～7#标样。

2.标样的测定

采用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法对1#标样～7#标样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到1#标样～7#标样谱图，记录各标样谱图中tafc、bmgt和非那西丁的峰面积，其中1#标样谱图如图1所示，图1中，从上至下三个谱图中的峰依次为tafc、bmgt和内标物非那西丁(图中标示为is)的峰；

色谱条件：采用agilentextendc18色谱柱(规格3.0×100mm，柱填料粒径3.5μm)，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，柱温35℃、流速0.4ml/min、进样量3μl，流动相a为0.1wt％的甲酸水溶液，流动相b为乙腈。

梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相b的体积百分数为25％、流动相a的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相b的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相a的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min至6.5min，洗脱液中流动相b的体积百分数为95％、流动相a的体积百分数为5％；

质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500v，干燥气温度350℃，干燥气流速5l/min，鞘气温度350℃，鞘气流速11l/min，deltaemv300v；测定醋酸镰孢氨酸c的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240v，碰撞电压为65v；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76v，碰撞电压为5v；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为138.3，碎裂电压为120v，碰撞电压为15v。

3.绘制工作曲线

以各标样中tafc的浓度为横坐标，以各标样谱图中tafc与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制tafc在1.56～100ng/ml浓度范围的工作曲线，如图2所示，用加权(w＝1/x²)最小二乘法进行回归运算，得到tafc工作曲线的线性回归方程为y＝0.03095x+6.82×10^-3，该线性回归方程中，y为tafc与非那西丁的峰面积比值，x为tafc的浓度，线性回归方程的相关性系数r值为0.9997。

以各标样中bmgt的浓度为横坐标，以各标样谱图中bmgt与非那西丁的峰面积比值为纵坐标，绘制bmgt在1.56～100ng/ml浓度范围的工作曲线，如图3所示用加权(w＝1/x²)最小二乘法进行回归运算，得到bmgt工作曲线的线性回归方程为y＝0.05647x+4.62×10^-4，该线性回归方程中，y为bmgt与非那西丁的峰面积比值，x为bmgt的浓度，线性回归方程的相关性系数r值为0.9980。

实施例2

本实施例中，对标样进行测试，以考察本发明所述方法的精密度与准确度，步骤如下：

1.标样的制备

(1)准确称量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt浓度均为10mg/ml的混合储备液。

取混合储备液3份，用乙腈稀释得到1#～3#混合标准液，1#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为31.25ng/ml，2#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为125.00ng/ml，3#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为500.00ng/ml。

(2)称取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁储备液，取适量非那西丁储备液用乙腈稀释得到内标溶液，该内标溶液中非那西丁的浓度为13.8ng/ml。

(3)取1#～3#混合标准液各10μl，分别向1#～3#混合标准液中加入100μl空白痰液和10μl内标溶液，涡旋混匀，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干并将所得固态物质乙腈体积百分数为50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后离心，所得上清液即为标样，依次记作1#标样～3#标样。

2.标样的测定以及精密度和准确度的计算

采用lc-ms/ms法对1#标样～3#标样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，每个浓度的标样平行6份，平行测定3天，记录各标样谱图，计算日内、日间精密度和准确度，结果如表1所示。

色谱条件：采用agilentextendc18色谱柱(规格3.0×100mm，柱填料粒径3.5μm)，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，柱温35℃、流速0.4ml/min、进样量3μl，流动相a为0.1wt％的甲酸水溶液，流动相b为乙腈。

梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相b的体积百分数为25％、流动相a的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相b的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相a的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min至6.5min，洗脱液中流动相b的体积百分数为95％、流动相a的体积百分数为5％；

质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500v，干燥气温度350℃，干燥气流速5l/min，鞘气温度350℃，鞘气流速11l/min，deltaemv300v；测定醋酸镰孢氨酸c的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240v，碰撞电压为65v；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76v，碰撞电压为5v；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为138.3，碎裂电压为120v，碰撞电压为15v。

表1

由表1可知，本发明所述方法检测tafc和bmgt的日内、日间精密度相对标准偏差rsd不超过8％，符合小于15％的要求，准确度相对偏差re不超过±9％，符合不超过±15％范围的要求。

实施例3

本实施例中，考察基质效应和提取回收率，步骤如下：

1.配制混合标准液和内标溶液

(1)准确称量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt浓度均为10mg/ml的混合储备液。

取混合储备液3份，用乙腈稀释得到1#～3#混合标准液，1#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为31.25ng/ml，2#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为125.00ng/ml，3#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为500.00ng/ml。

(2)称取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁储备液，取适量非那西丁储备液用乙腈稀释得到内标溶液，该内标溶液中非那西丁的浓度为13.8ng/ml。

2.取3份空白痰液样品各100μl，分别向各空白痰液样品中加入乙腈10μl，涡旋混匀，然后分别加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一样本得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干，分别将所得固态物质用80μl乙腈体积百分数为37.5％的乙腈水溶液溶解，分别向所得溶液中加入10μl1#～3#混合标准液，再分别加入10μl内标溶液，涡旋混匀后按照实施例2中的条件进行lc-ms/ms分析，每个浓度考察6个不同来源的空白痰液样品，记录谱图。

取1#～3#混合标准液各10μl，分别向1#～3#混合标准液中加入10μl内标溶液和80μl乙腈体积百分数为37.5％的乙腈水溶液，涡旋混匀后按照实施例2中的条件进行lc-ms/ms分析，每个浓度的样品平行6份，记录谱图。

比较该步骤中的两种样品的谱图峰面积，得到tafc、bmgt和非那西丁在3个浓度的基质效应，结果如表2所示。

3.取1#～3#混合标准液各10μl，分别向1#～3#混合标准液中加入100μl空白痰液和10μl内标溶液，涡旋混匀，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干并将所得固态物质乙腈体积百分数为50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后离心，对所得上清液按照实施例2中的条件进行lc-ms/ms分析，每个浓度考察6个不同来源的空白痰液样品，记录谱图。

取3份空白痰液样品各100μl，分别向各空白痰液样品中加入乙腈10μl，涡旋混匀，然后分别加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一样本得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干，分别将所得固态物质用80μl乙腈体积百分数为37.5％的乙腈水溶液溶解，分别向所得溶液中加入10μl1#～3#混合标准液，再分别加入10μl内标溶液，涡旋混匀后按照实施例2中的条件进行lc-ms/ms分析，每个浓度考察6个不同来源的空白痰液样品，记录谱图。

比较该步骤中的两种样品的谱图峰面积，得到tafc、bmgt和非那西丁在3个浓度的绝对提取回收率结果如表2所示。

表2

实施例4

本实施例考察痰液样品的稳定性，步骤如下：

1.配制混合标准液体和内标溶液

(1)准确称量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt浓度均为10mg/ml的混合储备液。

取混合储备液3份，用乙腈稀释得到1#～3#混合标准液，1#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为31.25ng/ml，2#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为125.00ng/ml，3#混合标准液中tafc和bmgt浓度均为500.00ng/ml。

(2)称取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁储备液，取适量非那西丁储备液用乙腈稀释得到内标溶液，该内标溶液中非那西丁的浓度为13.8ng/ml。

2.未处理样品：取3份刚采集的空白痰液样品各100μl，立即向各痰液样品中分别加入1#～3#混合标准液10μl，室温(25℃)静置4h，分别加入内标溶液10μl，涡旋混匀，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干并将所得固态物质乙腈体积百分数为50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后离心，对所得上清液按照实施例2中的条件进行lc-ms/ms分析，每个浓度平行3份，记录谱图。

处理后的样品：取3份刚采集的空白痰液样品各100μl，立即向各痰液样品中分别加入1#～3#混合标准液10μl以及内标溶液10μl，涡旋混匀，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干并将所得固态物质乙腈体积百分数为50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后离心，将所得上清液在室温(25℃)放置24h，然后按照实施例2中的条件进行lc-ms/ms分析，每个浓度平行3份，记录谱图。

计算上述两种情况下的精密度相对标准偏差rsd和准确度相对偏差re，结果如表3所示，由表3可知，对于未处理样品和处理后的样品，精密度相对标准偏差rsd均不超过10％，准确度相对偏差re不超过±8％，这说明采集的痰液样品未经处理在室温放置不超过4h、采集的痰液样品在经过处理后在室温放置不超过24h是稳定的，不会影响检测结果准确性。

表3

实施例5

本实施例中，采用本发明所述方法对3个痰液样品进行测定，将3份痰液样本编号为a#、b#、c#痰液样品，步骤如下：

1.试样的制备

(1)称取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁储备液，取适量非那西丁储备液用乙腈稀释得到内标溶液，该内标溶液中非那西丁的浓度为13.8ng/ml。

(2)取a#、b#、c#痰液样品各100μl，分别其中加入内标溶液10μl，涡旋混匀，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮气下吹干并将所得固态物质乙腈体积百分数为50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后离心，所得上清液即为试样，依次记作a#、b#、c#试样。

2.试样的测定

采用lc-ms/ms法对a#、b#、c#试样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到a#、b#、c#试样谱图，记录各试样谱图中tafc、bmgt和非那西丁的峰面积；

色谱条件：采用agilentextendc18色谱柱(规格3.0×100mm，柱填料粒径3.5μm)，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，柱温35℃、流速0.4ml/min、进样量3μl，流动相a为0.1wt％的甲酸水溶液，流动相b为乙腈。

梯度洗脱条件为：在0min至1min，洗脱液中流动相b的体积百分数为25％、流动相a的体积百分数为75％，在大于1min至4min，洗脱液中流动相b的体积百分数由25％线性增加至95％、流动相a的体积百分数由75％线性减少至5％，在大于4min至6.5min，洗脱液中流动相b的体积百分数为95％、流动相a的体积百分数为5％；

质谱条件：电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测方式，毛细管电压3500v，干燥气温度350℃，干燥气流速5l/min，鞘气温度350℃，鞘气流速11l/min，deltaemv300v；测定醋酸镰孢氨酸c的母离子的质荷比m/z为928.3，子离子的质荷比m/z为251，碎裂电压为240v，碰撞电压为65v；测定双甲硫基胶霉毒素的母离子的质荷比m/z为357.1，子离子的质荷比m/z为309.1，碎裂电压为76v，碰撞电压为5v；测定非那西丁的质荷比m/z为180.1，子离子的质荷比m/z为138.3，碎裂电压为120v，碰撞电压为15v。

3.检测结果的获取

将a#、b#、c#试样谱图中tafc与非那西丁的峰面积比值、bmgt与非那西丁的峰面积比值分别带入实施例1确定的tafc和bmgt的工作曲线的线性回归方程中，计算出各试样中tafc和bmgt的浓度，结果如表4所示。

表4