一种呋喃西林生物标识物5‑硝基‑2‑糠醛的气相色谱质谱检测方法与流程

本发明涉及一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的检测方法，特别涉及一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的气相色谱质谱检测方法。

背景技术：

硝基呋喃类药物的化学性质不稳定，尤其对光照等十分敏感，而且在生物体内代谢速率非常快，浓度半衰期从几小时到十几小时不等，动物喂药24小时之后体内基本检测不到硝基呋喃原形药的存在。因此，从饲料或用药动物体内检测硝基呋喃原形药是比较困难且不准确的，原药的残留量不足以反映真实的用药情况。然而，硝基呋喃的代谢产物与组织蛋白结合后在生物体内却可以长期存在，研究表明在停药56天后检测，动物体内仍然可以检测到稳定含量的代谢产残留物。一直以来，对硝基呋喃类抗生素的违禁检测，是通过对其生物标示残留物的测定。以检测呋喃西林的代谢物氨基脲(sem)为例，在适当的酸性水解氛围下，与组织蛋白结合的sem会重新游离出来。从检测的角度出发，sem是一类小分子量化合物，对液相色谱常用的紫外和荧光检测器响应均不理想，因而加入2-硝基苯甲醛(2-nba)作为衍生化试剂，衍生产物nba-sem经过分离纯化后，用uplc/ms/ms分析，检测限可达欧盟法规要求的1μg/kg。

目前针对呋喃西林违禁用药的检测方法主要有高效液相色谱与质谱、紫外、荧光检测器联用法、分光光度法，薄层色谱法以及免疫分析法等，基于氨基脲(sem)为生物标示物的检测方法无法分辨“阳性”的sem究竟来自于呋喃西林还是自然产生。这也使得沿用至今的sem是否能够继续作为呋喃西林检测的标示物在业内引起了巨大争议。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的气相色谱质谱检测方法，以5-硝基-2-糠醛(nf)为检测对象，采用高氯酸为氧化性试剂将目标物首先氧化成有机酸，随后在浓硫酸的催化作用下与甲醇进行酯化反应，最终转化为热稳定性稳定好、质谱检测器下响应灵敏的化合物，突破现有研究无法克服内源性等非呋喃西林源生物标示物产生的局限性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的气相色谱质谱检测方法，包括如下步骤：

(1)待检测液制备

称取1.0±0.1g的样品，放入50毫升的样品管内，加入2毫升高氯酸，充分涡旋后，避光放置于40℃的水浴中氧化反应20分钟，加入100μl甲醇，5毫升浓硫酸，充分涡旋后，避光放置于60℃的水浴中酯化反应20分钟后，冷却至室温，加入2毫升正己烷，充分涡旋后，6000转/min离心五分钟，取1.0毫升上清液用0.2μm的滤膜过滤，得待检测液供气相色谱串联质谱仪分析；

(2)gc-ms分析

待检测液经气相色谱串联质谱仪检测分析，外标法定量。

作为优选，所述高氯酸酸的浓度为12mol/l。

作为优选，所述硫酸浓度为18.4mol/l。

作为优选，气相色谱检测条件为：色谱柱：db-5ms弹性石英毛细管柱柱，规格：30m*0.25mm*0.25μm；载气为纯度大于99.99％的高纯氦气，流量1.0ml/min；柱温为80℃保持1min，以20℃/min升至250℃，保持10min；进样口温度为220℃；不分流进样模式，进样量1.0μl

作为优选，质谱检测条件为：离子源温度230℃，电子轰击能量70ev，接口温度260℃，四级杆温度150℃，质谱扫描方式为全扫描模式和选择离子检测模式：质量扫描范围m/z50-450，选择监测质量数m/z为113.0，171.0，溶剂延迟3min。

作为优选，外标法定量，采用5-硝基-2-糠酸甲酯作为标准品，绘制标准曲线时5-硝基-2-糠酸甲酯标准工作溶液的浓度设置为1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml。

作为优选，5-硝基-2-糠酸甲酯标准工作溶液由外标储备液稀释而得，外标储备液的制备方法为：将10毫克5-硝基-2-糠酸甲酯溶解在10毫升正己烷中，用移液器取10微升上述溶液，然后用正己烷定容至10毫升的容量瓶里，制得浓度为1.0mg/l的外标储备液。

本发明的有益效果是：以5-硝基-2-糠醛(nf)为检测对象，采用高氯酸为氧化性试剂将目标物首先氧化成有机酸，随后在浓硫酸的催化作用下与甲醇进行酯化反应，最终转化为热稳定性稳定好、质谱检测器下响应灵敏的化合物，突破现有研究无法克服内源性等非呋喃西林源生物标示物产生的局限性。

附图说明

图1为标准溶液中5-硝基-2-糠酸甲酯的sim色谱图和质谱图(浓度20ng/ml)。

图2为标准溶液中5-硝基-2-糠酸甲酯的scan色谱图和质谱图(浓度20ng/ml)。

图3为梭子蟹中5-硝基-2-糠酸甲酯的scan色谱图和质谱图(浓度5.0ng/ml)。

图4为5-硝基-2-糠酸甲酯标准质谱图及分子结构图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种呋喃西林生物标识物5-硝基-2-糠醛的气相色谱质谱检测方法，包括如下步骤：

(1)待检测液制备

称取1.0±0.1g的样品，放入50毫升的样品管内，加入2毫升浓度为12mol/l的高氯酸，充分涡旋后，避光放置于40℃的水浴中氧化反应20分钟，加入100μl甲醇，5毫升浓度为18.4mol/l的浓硫酸，充分涡旋后，避光放置于60℃的水浴中酯化反应20分钟后，冷却至室温，加入2毫升正己烷，充分涡旋后，6000转/min离心五分钟，取1.0毫升上清液用0.2μm的滤膜过滤，得待检测液供气相色谱串联质谱仪分析。

(2)gc-ms分析

待检测液经气相色谱串联质谱仪检测分析，外标法定量。

气相色谱检测条件为：色谱柱：db-5ms弹性石英毛细管柱柱，规格：30m*0.25mm*0.25μm；载气为纯度大于99.99％的高纯氦气，流量1.0ml/min；柱温为80℃保持1min，以20℃/min升至250℃，保持10min；进样口温度为220℃；不分流进样模式，进样量1.0μl。

质谱检测条件为：离子源(ei)温度230℃，电子轰击能量70ev，接口温度260℃，四级杆温度150℃，质谱扫描方式为全扫描(scan)模式和选择离子检测(sim)模式：质量扫描范围m/z50-450，选择监测质量数(m/z)为113.0，171.0，溶剂延迟3min。

外标法定量，采用5-硝基-2-糠酸甲酯作为标准品，绘制标准曲线时5-硝基-2-糠酸甲酯标准工作溶液的浓度设置为1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml。

(3)方法的线性范围和检出限

外标储备液的配置：将10毫克5-硝基-2-糠酸甲酯溶解在10毫升正己烷中，用移液器取10微升上述溶液(指10毫克5-硝基-2-糠酸甲酯溶解在10毫升正己烷中形成的溶液)，然后用正己烷定容至10毫升的容量瓶里，制得浓度为1.0mg/l的外标储备液。

配制一系列不同浓度的5-硝基-2-糠酸甲酯标准工作溶液，1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml，经步骤(2)，依次进样，分别以5-硝基-2-糠酸甲酯的峰面积为纵坐标，以相应的浓度值为横坐标，作标准曲线，结果表明，5-硝基-2-糠酸甲酯在1.0-50.0ng/ml浓度范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r²大于0.999。

标准溶液中5-硝基-2-糠酸甲酯的sim色谱图和质谱图见图1，标准溶液中5-硝基-2-糠酸甲酯的scan色谱图和质谱图见图2，5-硝基-2-糠酸甲酯标准质谱图及分子结构图见图4。

(4)长期稳定性和特异性

在两个月的时间内，将5-硝基-2-糠酸甲酯标准溶液每隔两周分析一次，色谱峰面积的相对标准偏差小于7％，这表明5-硝基-2-糠酸甲酯具备足够的稳定性，可以存放数月。用分析不同种类空白样品(鱼，蟹和虾)的方式考察衍生物的特异性。结果显示，检测目标物附近没有基质效应的干扰作用。梭子蟹中5-硝基-2-糠酸甲酯的scan色谱图和质谱图见图3。

研究表明，nf的加标回收率很低，尽管将前处理方法经过各种优化，回收率依然维持在50％以下，究其原因可能是nf化学性质不太稳定，具有光和空气敏感性。这也是以nf为目标物的检测方法报道极少的原因之一。以高氯酸为氧化性试剂将目标物首先氧化成有机酸，随后在浓硫酸的催化作用下与甲醇进行酯化反应，最终转化为热稳定性稳定好、质谱检测器下响应灵敏的化合物5-硝基-2-糠酸甲酯，满足了定量测试的要求。

实际样品测定

采用本方法对水产品批发市场采购的10份梭子蟹和20份海捕的虾蛄中的nf残留量进行测定，其中有5个样品中检出nf含量在2.0-3.5ng/g之间。

结论

本实验以以高氯酸为氧化性试剂将目标物首先氧化成有机酸，随后在浓硫酸的催化作用下与甲醇进行酯化反应，气相色谱-质谱法测定水产品中痕量呋喃西林代谢物5-硝基-2-糠醛残留量。结果表明，本方法具有简便、灵敏、准确的优点，可以用于水产品中痕量呋喃西林代谢物的定性和定量分析。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。