本发明涉及大白菜根肿菌的单孢分离方法，是植物致病菌生理小种分离技术，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：：十字花科作物根肿病也称根癌，是由芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicae)侵染引起的世界性土传病害，严重影响大白菜及其他十字花科作物的生产。由于根肿菌通常以多个生理小种混生状态进行侵染，使得其抗性不能持久，因此通过根肿菌单孢分离技术，分离各根肿菌生理小种具有重要的应用价值。目前利用根肿菌单孢分离技术进行生理小种鉴定的研究已有一些报道，如2008年，xue等采用培养皿培养结合菌土培养的方法进行了单孢分离，利用5个菌株获得的3个生理小种感染率大多都在6％以下，最大感染率16.95％[xue等，2008年，isolationandvariationinvirulenceofsingle-sporeisolatesofplasmodiophorabrassicaefromcanada,plantdisease,29(3):456-462]；2012年李茜等利用微管吸附法单孢分离技术进行根肿菌单孢分离，利用2个菌株获得了4个生理小种，其侵染率在1.49-3.96％之间[李茜等，2012，芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicae)单孢分离接种及生理小种的鉴定，植物保护，2012,38(3):95-101]。从这些研究结果可见，利用现有的技术分离到的生理小种非常有限，其主要原因是受限于分离技术不够完善，尤其是侵染率过低，成苗率也不高所致。因此本研究主要目的是开发一种侵染率、发病率和成苗率都较高的单孢分离方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种快速分离根肿菌单孢的方法，建立较为完善的单孢分离技术及后续鉴定生理小种体系。本分离方法方便快捷、提高了植株成活率和植株的发病率，降低了鉴定生理小种时混孢的概率，适应推广应用。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：(1)冷冻盒滤纸培养将含有单孢的1％的琼脂块移入冷冻盒中，置滤纸培育的大白菜2日龄幼苗根上进行接菌。首先在冷冻盒中以温度23℃，湿度60％进行暗培养。注意一定要让琼脂块带单孢菌面接触到根毛，以便于根肿菌的侵染。(2)过渡培养由于冷冻盒生长空间有限，生长6天后，进行水培培养，将幼苗转移到带海绵的装有蒸馏水的2ml离心管中，放在不透光的离心管盒内在光照培养箱中在温度23℃，湿度60％和光照16h/d的环境下培养2天后，换霍格兰氏(hongland’s)营养液进行水培，注意每天需要用注射器补充营养液至2ml。直到显微镜压片观察到根毛被侵染时，将幼苗转至灭菌基质培养，基质由草炭、珍珠岩、蛭石组成，重量比为7:2:1，待幼苗长至4片真叶后，进行无菌土培养，40天后收集根肿用于生理小种鉴定。本发明的方法与现有技术相比具有以下优点：本发明首次建立了较为完善的单孢分离技术体系，前人研究中单孢分离侵染率低(仅1.5-4％)，本发明通过接菌方法改进使发病率提高到47.86％，并通过接菌幼苗时期选择及培养条件优化使植株成活率从27％提高到67％，同时缩短了实验进程。附图说明图1是菌液水培示意图。图2是琼脂块滤纸法示意图。图3是1日龄幼苗接菌32天示意图。图4是2日龄幼苗接菌12天示意图。图5是3日龄幼苗接菌12天示意图。图6是4日龄幼苗接菌24天示意图。图7是方案一植株培养流程。图8是方案二植株培养流程。图9是方案一植株生长状况。图10是方案二植株生长状况。图11是水培与基质培养植株最大叶片宽度(cm)平均值柱形图。图12是方案一获得的单孢植株发病植株。图13是方案二获得的单孢植株发病植株。图14是寄主发病状况。本发明与现有技术相比具有以下优点：本项目首次建立了较为完善的单孢分离技术体系，本发明的方法与现有技术相比积极效果表现在：(1)在本技术中增加的冷冻盒滤纸接菌培养步骤，使侵染率从1.5-16.95％提高到47.86％。(2)本技术中增加了基质培养过度步骤，使植株成活率从27％提高到67％，并缩短了实验进程。具体实施方式(1)菌液制备取1g发病病根，用无菌水冲洗3～5次，再经过灭菌的研钵进行研磨，直至根组织破碎，加入10ml无菌水，混合液经过8层纱布过滤，滤液3100r/min离心15min，弃上清液，将沉淀重新溶于50ml灭菌水，3100rpm离心15min，此步操作可重复2～3次，弃上清液，在沉淀中加4ml50％蔗糖溶液，摇匀，3100rpm离心10min，用移液枪把上清液移入干净的离心管，加30ml灭菌水，3100rpm离心15min，弃去上清液，沉淀重溶于30ml灭菌水，4000rpm离心5min，此步操作重复2次，最后沉淀溶于5ml灭菌水中备用，通过血球计数板来检测经过稀释的芸薹根肿菌孢子悬浮液的浓度。在进行单孢分离前进行镜检，保证在每0.5μl菌液中仅有1个单孢。(2)冷冻盒琼脂法单孢分离冷冻盒的每个小格上放入两层滤纸，加入少量的蒸馏水，使滤纸湿润，将大白菜常规种子均匀铺在滤纸上，置于25℃的黑暗环境下催芽24h。将最后获得的芸薹根肿菌孢子悬浮液稀释到孢子浓度为2000个/ml，用移液枪吸取80μl的1.0％的琼脂糖溶液滴在已经灭菌的载玻片上，缓慢的轻轻摇晃载玻片，15min左右琼脂糖凝固后，取0.5μl的悬浮液滴在凝固后的载玻片的琼脂糖上，置于16×40倍显微镜下进行观察逐渐调节视野，直至发现单个根肿菌游动孢子位于视野中央，再逐渐增大显微镜倍数进行观察，确定视野中央没有其他的孢子，再次将显微镜调到16×40倍物镜下。然后用特制的接种针在琼脂平板上进行剪切，不需要移动载玻片和显微镜，接种针可直接在载物台上进行操作。注意为了进一步核实在视野范围只包含1个孢子，观察切割后的琼脂平板上的划痕，以及划痕外部及附近有没有其他的孢子，则可以保证切下的为含单孢的琼脂块。在分离单孢过程中，接种针要用酒精灯火焰灼烧1min，然后放在无菌水中进行冷却。为避免接种针碰触到其他的游动孢子，落针点应该尽量在视野范围内的琼脂平板上。将含有单孢的1％的琼脂块移入冷冻盒中培育的2日龄幼苗根系上进行接菌，在温度为23℃，湿度为60％的环境下暗培养。注意此步骤时一定要让琼脂块带单孢菌面接触到根毛，以便于根肿菌的侵染。(3)过渡培养由于冷冻盒生长空间有限，生长6天后进行水培培养。将幼苗转移到带海绵的盛有蒸馏水的2ml离心管中，置离心管盒内，放入光照培养箱中，在温度23℃，湿度60％和光照16h/d的环境下培养2天后，换霍格兰氏(hongland’s)营养液进行水培，每天需要用注射器补充营养液至2ml。直到显微镜压片观察到根毛被侵染时，将幼苗转至灭菌基质培养，基质由草炭、珍珠岩、蛭石组成，其重量比例为7:2:1，待幼苗长至4片真叶后，进行下一步。(4)无菌土培养先在育苗钵中装体积2/3的无菌土(在灭菌锅中以121℃灭菌30min的育苗土)，将基质培养后的幼苗移入育苗钵中，上层铺上少许细沙，防止“跳根”，每株植株配有一个独立的托盘，在温度23℃～25℃，土壤湿度保持在70％～90％进行培养。(5)菌块收集植株进行无菌土培养40天后，进行洗根观察，对发病植株根瘤部分取样并编号，保存在-20℃冰箱中以便后期制备单孢菌液。洗根后的废水和菌土要进行收集统一处理，以免污染土壤。(6)威廉姆斯(williams)生理小种鉴定将威廉姆斯(williams)根肿菌鉴定寄主的种子消毒—温汤浸种(将种子用4层纱布包好，用橡皮筋扎紧，放在50℃的温水中浸泡30min，有规律的摆在培养皿中催芽)后催芽1天，在50孔装有无菌土的穴盘中进行播种，每穴2-3粒。播种后6天用2ml注射器将单孢菌液打入穴盘中(单孢菌液制备方法同菌液制备的方法，通过血球计数板计算使孢子浓度达到1x107个/ml)，将穴盘放置在无菌的环境中，注意每个穴盘之间要留有一定的空隙，每个穴盘都有一个独立的托盘，以免造成植株间的相互污染，定时定量的浇水，保持土壤湿度为75％～90％，同时种下感病品种进行对照待感病品种发病后调查植株的发病情况。病情调查标准：0级，根部无肿瘤，根系发育正常；1级，侧根着生少许肿瘤或主根稍有膨粗，有小但肉眼清晰可见的结节状肿块；3级，主根着生肿瘤，有明显的较大结节状或球状肿块；5级，主根上出现大的肿瘤，膨大成纺锤形，大的根肿一直延伸到下胚轴，植株矮小，生长停止。病情指数＜10为抗病，病情指数≥10为感病(strandberg&williams，1967)根据表1及病情调查结果确定生理小种。表1williams生理小种鉴别系统table1possiblehostreactionstoplasmodiophorabrassicaeracesinwilliamssystem注：+代表感病反应；-代表抗病反应note：+representssusceptiblereaction，-representsresistantreaction实施例1：侵染率调查琼脂法代替菌液水培进行单孢分离(图1)，琼脂法单孢分离是在含有1.0％的琼脂糖的载玻片上滴加合适浓度的的菌液，在显微镜下观察。将观察到单个孢子的琼脂块切下，继续观察，直到琼脂块中只有一个孢子为止。将含有单孢的琼脂块移入冷冻盒中培育的幼苗上进行接菌，几天后进行水培，直到根系被侵染后进行基质培养(图2)。在这一步骤中改进了原有的技术，用冷冻盒代替普通培养基，节约成本，保证单个孢子有充分的时间接触根毛提高侵染率，并用普通的载玻片代替以前的凹面载玻片，用这用方式每次可以在显微镜下观察2-3个单孢，节约成本与时间。通过这种方法大大的提高了侵染率。通过实验结果比对，菌液水培法的侵染率为1.5-4％(李茜等，2012)，本实验所用的琼脂块滤纸法的侵染率提高到了47.86％。实施例2：接菌苗龄的确定分别选择1日龄、2日龄、3日龄和4日龄时期的幼苗进行单孢接菌，结果发现1日龄幼苗接菌后32天才被侵染，2日龄和3日龄幼苗被侵染的时间较早，8天进入侵染初期，12天进入侵染盛期。而4日龄幼苗接菌24天被侵染。所以2日龄和3日龄为最佳接菌时期(见图3-6)。分析1日龄幼苗侵染慢可能是由于其刚发芽继续生长导致琼脂块移位所致。实施例3：植株成活率调查由于冷冻盒的空间有限，幼苗只能在冷冻盒中生长6天，后期要采用水培，传统方法中要将单孢苗放在离心管中进行培养，每日用注射器浇营养液来维持植株生长，费时费力，而且在这个过程中幼苗成活率低，后期培养也比较困难。实验比较发现，在幼苗侵染后转入灭菌的基质中可以大大改善之一问题。具体实验方法如下：以2日龄的幼苗为主进行试验，400棵植株，分二批进行培养，接菌几天后，一部分先水培，待侵染后转为土培(方案一)(见图7)；另一部分先水培，待侵染后进行基质培养(方案二)(见图8)，比较植株长势及成活率。通过这两个方案的比较，我们得到了以下结果：方案一的成活率为27％，方案二的成活率67％。水培与基质培养植株的生长状况(见图9、10)。为了使结果更具可信性我们通过对最大叶片宽度的测量比较适宜生长环境。实验证明基质培养比水培培养，植株存活率更高，生长更好，也节约了一半的时间(见图11)，进行基质培养一周后，水培苗和基质培养的生长情况差别不大，在生长3周后开始出现明显差别。实施例4：植株发病率调查待植株达到一定生长程度大约在35天左右进行病情调查，对发病植株进行取样。其中方案一发病率为54.1％，方案二发病率为63.01％。选取其中发病最为明显的植株进行比较，右侧植株方案一获得的单孢植株，左侧为方案二获得的单孢植株可以发现方案二更加适合，不但发病率有很大的提升，发病程度较原来的方法也大大加强了(见图12、13)。实施例5：生理小种鉴定由于单孢菌的特殊性，在这一步骤中要防止混孢出现的概率，而在以前的研究中普遍采用了菌土法进行接菌，但是这种方法混孢的几率较大，为了避免这一情况，我们采用了注射菌液的方法来进行接菌，不但保证了接菌质量也减少了混孢的可能。将消毒并催芽1天的寄主在含有不同单孢菌的穴盘上进行播种，每穴2-3粒种子，共鉴定40个单孢菌，每个单孢每个寄主分别调查30株，于5-25℃的温室培养60天后，进行病情调查。鉴定结果显示，除去本地区原有的4号生理小种外，我们还鉴定出了新的8号、9号、11号生理小种。其中4号生理小种为优势小种，所占比例达到57.5％，11号生理小种次之，占32.5％，9号生理小种只有三个，占7.5％，8号小种只有一个，占2.5％。对4个寄主进行williams鉴定分析，发现两个甘蓝鉴定寄主jq，bs对沈阳地区的根肿抗病性较强等,40个单孢中有wb,lt几乎100％发病，发病程度最重，jq发病率57.5％，发病程度最轻，bs发病率90％，发病程度较重(见图14)。当前第1页12当前第1页12