专利名称：尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法。
背景技术：
枯萎病是一类植物病害的总称，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫。枯萎病有细菌性病原(如香蕉细菌性枯萎病等)和真菌性病原两种。本发明所指的枯萎病为真菌性病原，是由镰刀菌属真菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害，其中尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum Schl.)是主要病菌种类之一。尖孢镰刀菌属半知菌类(Fungiimperfecti)、梗孢目(Moniliales)、痤孢科(Tubercular)、镰刀菌属(Fusarium).自从Snyder和Hansen(1940)把镰刀菌属美丽组内的种合并为1个，成为尖孢镰刀菌。寄主范围(1)经济作物棉花、油桐、蓖麻、亚麻等；(2)茄科作物番茄、胡椒、茄子、烟草、马铃薯等；(3)瓜类作物黄瓜、节瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜、白瓜、越瓜、苦瓜、葫芦瓜、哈密瓜等；(4)豆科作物大豆、四季豆、豇豆、猪屎豆、豌豆等；(5)花卉植物康乃馨、郁金香、鱼尾菊、非洲菊、鸢尾、水仙、翠菊、合欢、百合、仙人掌、穿心莲、一品红、草坪草等；(6)林果植物松树、相思树、柑桔、沙棘、水杉、铁线莲属植物、梨树等；(7)其它植物莴苣、小麦、大蒜、荸荠、芦笋、姜、香蕉等。植株被尖孢镰刀菌侵染后，发病症状多种多样，一般导致维管束枯萎、植株枯黄、球茎和根腐烂，植株生长衰弱。植株发病后，最初的症状表现嫩叶上出现轻微的褪绿，而后老叶开始下垂。苗期植株发病后迅速死亡；成株期产生叶脉失绿和叶片下垂，植株生长缓慢、下部叶片黄化、不定根形成、叶片和嫩茎萎蔫、落叶、剩余叶片边缘坏死，最终导致全株死亡。维管束组织的褐变是尖孢镰刀菌引起的枯萎病最明显的特征，如西瓜枯萎病在较老的植株上，从盛花期到果实成熟期，症状会变得更明显。
通过应用了弱株系交互保护作用的原理，利用无致病力尖孢镰刀菌，可产生诱导抗性作用枯萎病无致病力菌株能诱导寄主的抗病机制。如文献“瓜类植物诱导抗病性研究”所示，王守正等研究了西瓜、黄瓜对枯萎病和炭疽病的诱导抗病机制，结果发现西瓜、黄瓜经枯萎病无致病力菌株诱导后与抗病性有关的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性明显增强，酚类物质和木质素含量增多。西瓜、黄瓜对枯萎病的诱导抗病机制和黄瓜对炭疽病的诱导抗病机制基本一致。用从西瓜维管束中分离到的尖孢镰刀菌无致病力菌株F0-3和茄病镰刀菌无致病力株F5-1诱导处理西瓜幼苗，能使西瓜产生对枯萎病的抗性。
然而作为微生物之间的这种干扰作用，往往因各种因素影响产生变化，如无致病力尖孢镰刀菌会恢复致病力、失去竞争力等，导致保护作用降低，因而，在大面积应用上必须建立一套检测技术，能有效的鉴别尖孢镰刀菌无致病力菌株，使其能更好的利用无致病力尖孢镰刀菌的诱导寄主的抗病机制，防治植物的枯萎病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，此检测方法能有效的鉴别尖孢镰刀菌无致病力菌株，从而利用尖孢镰刀菌无致病力菌株作为免疫接种剂防治枯萎病病害。
为了达到上述目的，本发明的解决方案是一种尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，包括如下步骤(a)尖孢镰刀菌同工酶检测；(b)尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测；(c)尖孢镰刀菌ITS(Internal Transcribed Spacer，ITS)测序检测；(d)尖孢镰刀菌特异性引物R10/L10检测；(e)尖孢镰刀菌液体培养检测。
所述的尖孢镰刀菌同工酶检测，采用的缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—甘氨酸缓冲液)，pH8.3。
所述的尖孢镰刀菌同工酶检测，样品保存温度为-20℃冷冻保存。
所述的尖孢镰刀菌同工酶检测，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定相对比移值Rf，Rf＝酶带迁移距离/前沿指示剂迁移距离。
尖孢镰刀菌同工酶检测步骤包括菌体的收集，菌株培养7d后，收集菌丝，-20℃保存备用。样品的制备，将菌丝置于研钵中，按照1∶2(W/V)的比例与10×Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)混合，冰浴研磨，冷冻离心，取上清液，加入等体积的40％蔗糖溶液混合，-20℃冷冻保存。过氧化物酶同工酶电泳，(1)凝胶的制备采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，(2)点样用加样器点样，每个样品上样量为100μL，以0.01％的溴酚蓝为前沿指示剂。(3)电泳加样后，在冰箱内电泳。(4)染色过氧化物酶(POD)同工酶染色联苯胺用无水乙醇热溶，分别加入乙酸和乙酸钠，然后加入蒸馏水和H2O2混合，将凝胶放入染色液中，待酶带全部显示清晰后，用蒸馏水清洗凝胶，拍照，测定Rf值后，7％醋酸保存。(5)Rf值的计算Rf＝酶带迁移距离/前沿指示剂迁移距离。
所述尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测，采用PSA液体培养基。
所述尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测，采用的缓冲液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
所述的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液加入量为0.9mL，Na2HPO4浓度为0.2mol/L，柠檬酸浓度为0.1mol/L。
所述尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测，利用分光光度计进行吸广度OD的测定。
尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测步骤包括(1)菌株的培养和发酵滤液的收集，采用PSA液体培养基，25℃条件下，培养14d后，用双层纱布过滤除去菌丝，取上清液进行测定。(2)β-葡萄糖苷酶活性测定方法，稀释的粗酶液中加入0.9mL Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，经反应后测吸光值OD。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。(3)β-葡萄糖苷酶活性的表示方法，在上述条件下，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力，定义为一个酶活单位。
所述的尖孢镰刀菌ITS测序检测，采用的缓冲液为Tris-HCl，NaCl，EDTA混合后的提取缓冲液。
所述的Tris-HCl，NaCl，EDTA提取缓冲液的加入量为500μL，其中Tris-HCl浓度为5mM/L，NaCl浓度为150mM/L，EDTA浓度为100mM/L。
所述的尖孢镰刀菌ITS测序检测，采用的引物Primer 15’CTTGCGTTGATTACGTCCC 3’；Primer 2(ITS4)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’。
所述的尖孢镰刀菌ITS测序检测，采用在含有1.5％的琼脂糖凝胶中电泳以检查结果。
尖孢镰刀菌ITS测序检测步骤包括(1)菌株DNA制备，①菌丝干粉放入离心管；②加入500μL提取缓冲液(Tris-HCl，NaCl，EDTA)悬浮干粉，在涡流振荡器上混匀；③加入SDS和蛋白酶K，37℃温浴；④加入NaCl和CTAB/NaCl溶液，65℃温浴；⑤用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1次，离心，取上清液移至干净管中；⑥将上清液，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次；⑦如水相与有机相之间仍有杂质，再重复抽提过程；⑧上清液中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA(-20℃放置1-2h)，离心；⑨取沉淀，加70％乙醇洗1遍；⑩真空干燥后将DNA溶解在TE缓冲液(Tris-HCl，EDTA)中。
(2)设计引物及DNA聚合酶如图5所示显示了本发明引物及DNA聚合酶的设计结构图。
(3)PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)-扩增，(4)扩增产物检测，取PCR产物在含有1.5％的琼脂糖凝胶中电泳以检查扩增结果，然后在Gel Doc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad)上观察并贮存图像。
所述的尖孢镰刀菌特异性引物R10/L10检测，采用的引物R105’CGAGACCGCCACTAGATTTC 3’；L105’ATCTCTTGGTTCTGGCATCG 3’。
尖孢镰刀菌特异引物R10/L10检测步骤包括(1)菌株DNA制备，采用CTAB法。(2)PCR扩增体系总体积25ul，包含双蒸水19.1ul，10 x PCR buffer2.5ul，dNTP 0.2ul，引物R10 1ul，引物L10 1ul，DNA 1ul，Taq酶0.2ul。(3)PCR扩增程序94℃预变性3分钟；接下来35个循环中包含94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。(4)扩增产物检测，取PCR产物在含有1.5％的琼脂糖凝胶中电泳以检查扩增结果，然后在Gel Doc2000凝胶成像系统(Bio-Rad)上观察并贮存图像。
尖孢镰刀菌液体培养检测步骤包括将各菌株在PSA平板上培养7d后，从平板上将菌丝刮入无菌水试管中配成了孢子悬浮液，过滤，滤液经血球计数板计数后配成孢子数相同的悬浮液，吸1mL到盛有PSA液体培养基中，于25℃下振荡培养14d。去除菌液接菌备用。各菌株分别取上述菌液处理黄瓜种子，每处吸适量菌液至已灭菌的三角瓶中，每瓶放入一定量粒黄瓜种子，以无菌水作对照。置于28℃，轻微振荡培养(提高通气量，促进发芽)，4d后转移至30℃的人工气候箱培养，观察用各菌株不同处理组对黄瓜植株的致病力差异，选择无发病组的菌株。培养至第14d时取各处理组植株，检测植株的根、茎基部、茎中部、茎顶部的菌的存在情况。方法取植株的根、茎基部、茎中部、茎顶部组织用0.1％升汞表面消毒后用无菌水清洗后置于PSA培养基平板上培养。
本发明建立了一套尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，来有效的鉴别尖孢镰刀菌无致病力菌株，枯萎病尖孢镰刀菌无致病力菌株能诱导寄主的抗病机制，以产生诱导抗性作用，是应用弱株系交互保护作用的原理。本发明从同工酶、β-葡萄糖苷酶、鉴别基因引物、液体培养接种的方法，建立尖孢镰刀菌无致病力菌株检测体系。此检测方法能有效的鉴别尖孢镰刀菌无致病力菌株，从而利用尖孢镰刀菌无致病力菌株作为免疫接种剂防治枯萎病病害。
图1是本发明的对硝基苯酚-光密度标准曲线。
图2是本发明的黄瓜尖孢镰刀菌的β-葡萄糖苷酶活性。
图3是本发明的9条序列两端修剪整齐后的比对结果ClusterW方法。
图4是本发明的强、弱毒株基因序列差异比较。
图5是本发明引物及DNA聚合酶的设计结构图。
具体实施例方式
1.尖孢镰刀菌同工酶检测步骤供试菌株及来源见表1，菌体的收集，将各菌株培养7d后，收集菌丝，用蒸馏水反复冲洗，最后用滤纸压干，-20℃保存备用。样品的制备，将菌丝置于研钵中，按照1∶2(W/V)的比例与10×Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)混合，冰浴研磨，12000rpm冷冻离心20min，取上清液，加入等体积的40％蔗糖溶液混合，-20℃冷冻保存。
过氧化物酶(POD)同工酶同工酶电泳，(1)凝胶的制备采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶4％，分离胶7％。(2)点样用加样器点样，每个样品上样量为100μL，以0.01％的溴酚蓝为前沿指示剂。(3)电泳加样后，在冰箱内电泳，先将电压调至120V，稳压电泳，待样品进入分离胶后，将电压调至150V，直至电泳结束，整个电泳过程大约7～8h。(4)染色，过氧化物酶(POD)同工酶染色0.1g联苯胺用5mL无水乙醇热溶，分别加入10mL，1.5mol/L乙酸和10mL，1.5mol/L乙酸钠，然后加入75mL蒸馏水和250μL 30％H2O2混合，将凝胶放入染色液中，待酶带全部显示清晰后，用蒸馏水清洗凝胶，拍照，测定Rf值后，7％醋酸保存。(5)相对比移值Rf的计算，Rf＝酶带迁移距离/前沿指示剂迁移距离。
检测结果如表2所示。从酶带数量上来看，在相同培养条件下，同一寄主不同部位分离的镰刀菌的POD同工酶条带是相同的，都是3条POD同工酶酶带，其迁移率分别为0.04；0.2；0.33。在POD同工酶表达的强弱上，同一寄主不同部位分离的镰刀菌存在着细微的差别，主要是3#菌株的POD同工酶，其第一条酶带和第二条酶带的着色较深，表达强度较强；而第三条酶带着色较浅，表达较弱。其它菌株的同工酶差别不大。同工酶酶带之间也存在着一定的差别，主要是表现在第一条和第二条酶带着色很深，表达很强；第三条酶带着色较浅，表达较弱。在黄瓜不同部位分离的尖孢镰刀菌的POD电泳显示，在酶带数量上是相同的，只是在表达强度上存在着一定的差别。
2.尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测步骤(1)菌株的培养和发酵滤液的收集，采用马铃薯蔗糖(PS)液体培养基，装瓶量为100mL，每瓶接入5个6mm的菌片，25℃条件下，120rpm，培养14d后，用双层纱布过滤除去菌丝，6000rpm离心10min，取上清液进行测定，试验重复3次。
(2)β-葡萄糖苷酶活性测定方法，取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mL pH5.0的0.2mol/L Na2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，于50℃恒温水浴预热5-10min，再加入已经预热5-10min的1mL 4mmol/L的p-NPG溶液，16min后立即加入1mL 1mol/L的NaCO3溶液终止反应，室温放置5min后，于400nm处测吸光值OD。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。
(3)β-葡萄糖苷酶活性的表示方法，在上述条件下，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力，定义为一个酶活单位。对硝基苯酚-光密度标准曲线如图1所示。
试验结果见表3和图2所示。黄瓜尖孢镰刀菌的β-葡萄糖苷酶活性分别为54.89u/mL、23.84u/mL、21.57u/mL、35.52u/mL和34.56u/mL。黄瓜植株的尖孢镰刀菌的β-葡萄糖苷酶活性差别较大，病株来源的尖孢镰刀菌的β-葡萄糖苷酶活性较高，分别为35.52u/mL和34.56u/mL；健株来源的尖孢镰刀菌的β-葡萄糖苷酶活性较低，分别为23.84u/mL和21.57u/mL。菌株119的β-葡萄糖苷酶活性最高，为54.89u/mL。
3.尖孢镰刀菌ITS测序检测步骤(1)菌株DNA制备方法①25mg菌丝干粉于1.5mL离心管；②加入500uL提取缓冲液(5mM/L Tris-HCl，pH8.0；150mM/L NaCl，100mM/LEDTA)悬浮干粉，在涡流振荡器上混匀；③加入50uL 10％SDS和2uL20mg/mL的蛋白酶K，37℃温浴1h；④加入75uL 5M/L NaCl和65uLCTAB/NaCl溶液，65℃温育20min；⑤用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1次，10,000g离心10min，取上清液移至干净管中；⑥将上清液，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次；⑦如水相与有机相之间仍有杂质，再重复抽提过程；⑧上清液中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA(-20℃放置1-2h)，10,000g离心10min；⑨取沉淀，加70％乙醇洗1遍；⑩真空干燥后将DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5；0.1mMEDTA中，-70℃保存)。
(2)设计引物及DNA聚合酶Primer 15’CTTGCGTTGATTACGTCCC 3’Primer 2(ITS4)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’如图形发生器所示，显示本发明引物及DNA聚合酶的设计结构图。
(3)PCR扩增PCR反应的总体积为25μL，含有1单位的Taq酶，10倍扩增缓冲液2.5μL，3mM/L MgCl2，每种dNTP 0.15mM/L，10pM/L的Primer 1和Primer 2各1μL，DNA模板25ng。PCR反应程序94℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共25个循环，最后72℃延伸10min。
(4)扩增产物检测PCR扩增结束后，取6μL PCR产物在含有1.5％的琼脂糖凝胶中电泳以检查扩增结果，然后在Gel Doc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad)上观察并贮存图像。
检测结果与分析目的片段18S-28S r DNA及ITS区的PCR扩增，PCR产物的纯化及测序，未纯化的PCR产物，通过用先割胶后过柱纯化的方法继续纯化，在自动DNA测序仪上进行序列测定。ITS1+5.8S+ITS2序列在GeneBank进行比对的结果见表4所示。
将测序结果9条序列两端修剪整齐后，用ClusterW方法，进行聚类分析，结果如图3所示；分析结果表明，9株尖孢镰刀菌分为2类，第1类包括了编号06、08、10、11尖孢镰刀菌，它们分别是甜瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-132，F-T.1.7-030520，采集地福州永泰，豌豆枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-117，F-W.6.2-030304，采集地漳州漳浦；黄瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-121，F-H.6.5-030318-J1，采集地漳州诏安，黄瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-123，F-H.6.5-030318-B3，采集地漳州诏安。第2类包括了编号05、07、09、12尖孢镰刀菌，它们分别是西瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-135，F-X.1.7-030520-(1-1)，采集地福州永泰，黄瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-124，F-H.6.5-030318-B1，采集地漳州诏安，黄瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-120，F-H.6.5-030318-J4，采集地漳州诏安，黄瓜枯萎病原尖孢镰刀菌菌株12-124，F-H.6.5-030318-B1，采集地漳州诏安。分析的结果与未切齐的一样，只是聚类的顺序不同。
测序结果见图4所示，强毒株与弱毒株之间基因存在着显著差异，序列标明的44个碱基弱毒株与强毒株之间不同，弱毒株内部差异不大。
4.尖孢镰刀菌特异性引物R10/L10检测步骤(1)DNA制备方法取200mg菌丝，用液氮研磨后置于1.5ml离心管；加CTAB缓冲液(20g CTAB/L，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl，20mmol/LEDTA，PH8.0)500ul；65℃水浴加热3min；加500ul苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混均；4℃，12000g，10min；取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混均；4℃，12000g，10min；取上清液至新管；加2倍体积沉淀液(5g CTAB/L，0.04mol/L NaCL)；室温1h；4℃，12000g，5min；弃上清液；加350ul NaCl(1.2mol/L)溶解沉淀；沉淀溶解后，加350ul氯仿混匀；4℃，12000g，10min；取上清液至新管；加0.6倍体积异丙醇，混匀；4℃，12000g，10min；弃上清；70％乙醇洗涤沉淀；干燥，加TE溶解。
(2)设计引物及DNA聚合酶R105’CGAGACCGCCACTAGATTTC 3’；L105’ATCTCTTGGTTCTGGCATCG 3’。
(3)CR扩增体系总体积25ul，包含双蒸水19.1ul，10 x PCRbuffer2.5ul，dNTP 0.2ul，引物R10 1ul，引物L10 1ul，DNA 1ul，Taq酶0.2ul。
(4)PCR扩增程序94℃预变性3分钟；接下来35个循环中包含94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。
(5)扩增产物检测取PCR产物在含有1.5％的琼脂糖凝胶中电泳以检查扩增结果，然后在Gel Doc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad)上观察并贮存图像。
检测结果与分析尖孢镰刀菌的强、弱菌株经特异引物R10/L10PCR扩增后，强菌株扩增出单一条带，大小为200bp；弱菌株扩增出两条带，大小分别为600bp和200bp。
5.尖孢镰刀菌液体培养检测步骤将各菌株在PSA平板上培养7d后，从平板上将菌丝刮入10mL的无菌水试管中配成了孢子悬浮液，用双层纱布过滤，滤液经血球计数板计数后配成孢子数相同的悬浮液，吸1mL到盛有100mL PSA液体培养基的250mL的三角瓶中，于25℃下振荡培养14d。过滤获得孢子悬浮液。分别取上述菌株孢子悬浮液处理黄瓜种子，每处理吸10mL孢子悬浮液至已灭菌的150mL的三角瓶中，每瓶放入20粒黄瓜种子，以无菌水作对照。置于28℃，60r/min下轻微振荡培养(提高通气量，促进发芽)，4d后转移至30℃的人工气候箱培养，观察用各菌株不同处理组对黄瓜植株的致病力差异，选择无发病组的菌株。培养至第14d时取各处理组植株，检测植株的根、茎基部、茎中部、茎顶部的菌的存在情况。方法取植株的根、茎基部、茎中部、茎顶部组织各1cm用0.1％升汞表面消毒后用无菌水清洗3遍后置于PSA培养基平板上培养。
第14d未发病植株组织体内病病原菌平板分离的结果，表明各菌株处理组植株均有枯萎病原菌侵入，只是还未表现病症，而清水对照组中未分离到枯萎病菌。
表1.供试菌种及来源
表2 同一寄主不同部位尖孢镰刀菌POD同工酶条带的分布及强弱对比情况
注强++++；中+++；弱++；浅+表3 黄瓜尖孢镰刀菌的β-葡萄糖苷酶活性
表4 使用ITS1+5.8S+ITS2序列在GeneBank进行比对的结果
权利要求
1.一种尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于包括如下步骤(a)尖孢镰刀菌同工酶检测；(b)尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测；(c)尖孢镰刀菌ITS测序检测；(d)尖孢镰刀菌特异性引物R10/L10检测；(e)尖孢镰刀菌液体培养检测。
2.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌同工酶检测，采用的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌同工酶检测，样品需冷冻保存。
4.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌同工酶检测，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定相对比移值Rf。
5.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测，采用马铃薯蔗糖液体培养基。
6.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测，采用的缓冲液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
7.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述尖孢镰刀菌β-葡萄糖苷酶检测，利用分光光度计进行吸广度的测定。
8.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌ITS测序检测，采用的缓冲液为Tris-HCl，NaCl，EDTA混合后的提取缓冲液。
9.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌ITS测序检测，采用的DNA聚合酶为Primer 15’CTTGCGTTGATTACGTCCC 3’；Primer 2(ITS4)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’。
10.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌R10/L10检测，采用的特异性引物为R105’CGAGACCGCCACTAGATTTC 3’；L105’ATCTCTTGGTTCTGGCATCG 3’。
11.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于所述的尖孢镰刀菌R10/L10检测、尖孢镰刀菌ITS测序检测，都采用在琼脂糖凝胶中电泳以检查结果。
全文摘要
本发明公开一种尖孢镰刀菌无致病力菌株的检测方法，其特征在于包括如下步骤(a)尖孢镰刀菌同工酶检测；(b)尖孢镰刀菌β－葡萄糖苷酶检测；(c)尖孢镰刀菌ITS测序检测；(d)尖孢镰刀菌液体培养检测，此检测方法能有效的鉴别尖孢镰刀菌无致病力菌株，从而利用尖孢镰刀菌无致病力菌株作为免疫接种剂防治枯萎病病害。
文档编号C12Q1/68GK101037704SQ20061013541
公开日2007年9月19日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者刘波, 朱育菁, 蓝江林, 肖荣凤, 林抗美, 郑雪芳, 曹宜, 苏明星, 史怀, 葛慈斌, 阮传清, 刘芸 申请人:福建省农业科学院生物技术研究所