专利名称：一种来自西太平洋热液区菌Sulfobacillus acidophilus的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高温菌，来自西太平洋热液区Sulfobacillus acidophilus。
背景技术：
据估计地球上约有3000多万种物种，目前己知仅有150万种。而海洋 占地球面积的七成，总水量的97%,它拥有地球上物种的80%以上。许多海洋 微生物常处于高压、高盐、髙温或低温环境等特别环境，具有不同大陆上微生物 的特性，由于繁多类型的海洋微生物所处独特的生态环境，造就了适应特殊环境 的特殊基因或基因组，有着各种各样的功能基因。生物冶金技术，又称生物浸出技术，通常指矿石的细菌氧化或生物氧化，由 自然界存在的微生物进行。这些微生物被称作适温细菌，大约有0.5-2.0微米 长、0. 5微米宽，只能在显微镜下看到，靠无机物生存，对生命无害。这些细 菌靠黄铁矿、砷黄铁矿和其他金属硫化物如黄铜矿和铜铀云母为生。适温细菌和 其他细菌通常生活在因硫氧化而产生的酸性环境中，如温泉、火山附近地区和富 含硫的地区。由澳大利亚一家公司培养的适温细菌最早是在西澳的一矿山中发现 的，在含硫的酸性环境中，在髙温条件下对可溶性金属有很好的聚积作用。适温细菌和其他"靠吃矿石为生"的细菌如何氧化酸性金属的机理不得而知。化学和 生物作用将酸性金属氧化变成可溶性的硫酸盐，不可溶解的贵金属留在残留物中，铁、 砷和其他贱金属，如铜、镍和锌进入溶液。溶液可与残留物分离，在溶液中和之前，采 取传统的加工方式，如溶剂萃取，来回收贱金属，如铜。残留物中可能存在的资金属， 经细菌氧化后，通过氡化物提取。发明内容-本发明从西太平洋热液区获取的，细菌名(拉丁语名Sulfobacillusacidophilus) 其主要表型特征革兰氏阳性、杆状、能够自养、异养、混和营养型、耐高温(最高能够耐受 到7(TC)、嗜酸、高活动性、具有浸矿能力。 与Acidithiobacillus ferrooxidans相比长处是耐受的温度更高。 与Leptospirillus ferrooxidans相比长处是耐受温度高，同时能够异养和自养两种 营养型。同时能够利用硫为能量来源。能够利用硫化矿物浸矿。 大小长杆状(0.3"0.8Xl-4um)
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图l此菌电镜照片。 图2为生长曲线。图3为浸矿活性。
具体实施方式
: 培养基成分MgS04 x 7 H200.5g(NH4)2S040.4K2HP040.2gKC10.1gDistilled water1000.0ml使用112804.调节pH为2。异养添加酵母提取物终浓度0.25 g/l.。 Fe含量10.0 mg/1 of FeS04 x 7 H20 自养Fe含量13.9 g/1 of FeS04 x 7 H20 (用112804调节其pH= 1.7) 固体培养基为液体培养基中加入1%的琼脂。 以上培养基使用前均需要髙温蒸汽121C灭菌15-20分钟。分离及筛选取热液区样品涂布平板，于45'C培养，得到单菌落，然后挑单菌落再次于新平 板上划线培养，得到单菌落，再划线，直到得到纯培养的菌株。鉴定通过该菌株的表型特征以及其16SrDNA序列鉴定。16SrDNA序列测序的方法 16SrDNA序列提交号bankit851655,登陆号EF088287。在Genbank中比对结果与标准株Sulfobacillus acidophilus DSM 10332株(登陆号 AB08诉42)以及NAL株(登陆号AF050169)的同源性均为99%。(一).提取基因组DNA:将初步鉴定为不同种的菌株提取Genomic DNA，方法如下1. 取对数期(否则不易裂解)细菌1.5-4.5ml, 12000rpm, lmin2. 用567uL的TE(pH8.0)重悬，加入3uL RNA酶(20ug/uL)，luL 溶菌酶(50mg/ml)，混匀，37'C 10min以上(此时菌液可能变 澄清);再加入30uL 10%的SDS(十二烷基磺酸钠)和3uL20mg/mL 的蛋白酶K,混匀，15min以上(此时菌液应为澄清， 否则菌不是处于对数期或是菌数太多而没有完全裂解)3. 加入100uL 5M NaCl,充分混匀，再加入80uL CTAB/NaCl溶 液(10%CTAB/0.7M NaCl:在80ml H20中溶解4.1gNaCl，缓 慢加入10g CTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热到65 T溶解。定容终体积至100ml) (CTAB:十六垸基三甲基溴化 铵)，混匀，于65°C lOmin4. 加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm5min,上 清移入新管5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:l)，混匀，12000rpm5min，上清移入新管6. 加入0.6体积的异丙醇(或2体积乙醇)，轻轻混匀直到DNA 沉淀下来，静置2min， 12000rpm 2min7. 去上清，70%乙醇洗两次，晾干。8. 加入30-60uLddH2O溶解DNA，一20'C保存。(二)16SrDNA扩增采用细菌的通用引物fD 1:5'-agagtttgatcctggctcag-3'rp2:5'-acggctaccttgttacgactt-3'PCR体系ddH20Genomic DNA:fDl:rp2:PCR bufferMg2+:dNTP:Taq13.5uL 4.50.5 ix L 0.5 2.5"2uL 0.5PCR程序95'CTotal94551C 72'C3min45s ， 45s 2min72'C 化lOmin pause25 uL30cycles(三) 胶回收将克隆的16SrDNA用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，然后用胶回收试 剂盒回收克隆片断(胶回收试剂盒够自上海华瞬生物工程有限公司)(四) 连接T-vector (T载体)1 L; T4 DNA ligase (连接酶)0.5 u L; lOxBuffer: luL; 16SrDNA:5uL; ddH20: 2.5 uL于16X:过夜连接. (连接酶以及T载体均够自晶美生物工程有限公司)(五) 制备感受态细胞1. 提前一天挑单菌落接种到试管中过夜培养2. 将试管中已经长好的大肠杆菌按照1:50或者1:75或者1:100 的比例接种到100mL新鲜LB培养基中，于37'C摇床中培养.3.直到OD6oo达到0.3-0.45，将菌液取出于冰上放置15min以上(一
般为半个小时左右)。4. 在4'C， 5000rpm条件下离心10min,取出后放在冰上，倒掉上 清液，加入0.1mol/L的CaCl2,使沉淀细胞重悬，并尽量分散 均匀。5. 于冰上放置30min后，4'C于5000rpm离心10min，倒去上清液，6. 加入4-8mL的0.1mol/LCaCl2(含15%的甘油)，使之重悬，并分 散均匀，按照每管100uL分装到1.5mL的EP管中，于一 70 匸保存待用.(六) 转化1. 取大肠杆菌感受态细胞100uL(冰上融化)；2. 加入5 u L连接体系，用移液枪吸打均匀(轻吸),于冰上放置30min; 3.42"水浴90s，不要摇动管.4. 将管快速转移到冰浴中，是细胞冷却2min.5. 每管加入200uL的LB培养基，于37'C摇床温育，使菌体富集，但注 意转速要低于160rpm.6. 将菌液涂布平板在含有氨苄抗生素的LB平板培养基上，于371C 倒置培养过夜.(七) 菌落PCR: 引物序列M13M1: AGTC ACGACGTTGTA M13RV:C AGGAA AC AGCTATGAC1、 PCR体系ddH20 16.5 uLM13M1 luLM13RV lliLPCR buffer (10x) 2.5 ixLdNTP 2 u LMg2+: 1.5 uLTotal 24.5uL2、 挑单菌落接种于PCR体系中，同时对应接种到含3mlLBA+液体培 养基中。3、 液体培养放于37'C培养。4、 PCR体系于99'C10min后，加入Taq酶0.5 u L后进行PCR循环。 PCR程序95 C 15min35cycles72 C 10min 4°C pause (八)电泳检测用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测是否有条带扩增出来.5 5 m4 4 2P P P4 5 29 5 7
若有1.5kb的明显条带则说明挑选的是阳性克隆，16SrDNA已经转 化进大肠杆菌，取对应的菌液直接送往上海生工测序.序列表16SrDNA序列CAGCGGTAGTGCCAAGAGCATGACGGCAGTGGACGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCGTAATACATGCAAGTCGAGCGGTCGACGGCTCTTCGGAGGCGTCGGCAGCGGCGGACGGGTGAGGAACACGTGAGTAACCGGGCGTCCGGTGGGGGATATCGGGCCGAAAGGCGCGGCAATCCCGCATGCGCCCCGGGCGGCGCCAGCCGCCGGGGGGAAAGGCCTTCGGGTCGCCGGACGGGGGGCTCGCGGCCCATTAGCTAGTTGGGGGGGTAACGGCCTCCCAAGGCGACGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTCTGTCGGGACGAGGACCGCGCCGTCCGGCGCGGGGGGACGGTACCGGCGGAGGAAGCCCCTGCAAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGTGTAGGCGGTTGCGCATGTAGCGGTTTTCAGCCGTCGGCTCACCCGACGGAGGGCGGCTAAACGGCGCAGCTCGAGGGCAGGAGAGGTGCATGGAATTCCTGGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTGCACTGGCCTGGCCCTGACGCTGAGGCGCGACAGCGTGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACGAGGTGTCGCGGGGGTCCACCTCGCGGTGCCGGAGCTAACGCACTCAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGGCTAGACGGGACCGTGAGCCGCGCGAAAGCGCGGGGCTGCTTCGGCAGAGCGGTCGTCAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCGGCTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGCACTCAGCCGAGACAGCCGGGGACGACCCGGGGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCCGCATGGCCTTCATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCCGACAACGGGCCGCGACCTCGCGAGGGGGAGCGAATCCTTCAAACGGCGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTCGGCCACACCCGAAGCCGGTCGGTCGAACCCTGTCAGGGGACGACCCCGTCGACGGTGGGGCGGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTCGTAATCAGTCCATTGTT
权利要求
1. 一种从西太平洋热液区菌Sulfobacillus acidophilus，其特征为革兰氏阳性、杆状、能够自养、异养、混和营养型、耐高温、嗜酸、高活动性、具有浸矿能力。
2、 根据权利要求1所述的一种来自于西太平洋热液区菌Sulfobacillus acidophilus,其特征在于所述菌株为16SrDNA序列。
全文摘要
本发明提供了一种从西太平洋热液区获取的，细菌名(拉丁语名Sulfobacillus acidophilus)，其主要表型特征革兰氏阳性、杆状、能够自养、异养、混和营养型、耐高温(最高能够耐受到70℃)、嗜酸、高活动性、具有浸矿能力。与Acidithiobacillus ferrooxidans相比长处是耐受的温度更高。与Leptospirillus ferrooxidans相比长处是耐受温度高，同时能够异养和自养两种营养型。同时能够利用硫为能量来源。能够利用硫化矿物浸矿。
文档编号C12N1/20GK101210225SQ200610135418
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月31日 优先权日2006年12月31日
发明者红 陈, 陈新华 申请人:国家海洋局第三海洋研究所