一种阪崎肠杆菌的LAMP引物组及试剂盒与使用方法与流程

技术领域：

本发明属于食品安全的分子生物学检测方法领域，特别涉及一种阪崎肠杆菌的LAMP引物组及试剂盒与使用方法。

背景技术：
：

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科。2002年国际食品微生物标准化委员会（ICMSF）把阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期硬性”的一种致病菌。阪崎肠杆菌可以对任何年龄段的人群引起疾病，成人患病则明显轻微。但对1岁以下，特别是出生28d以内、早产儿、低体重儿或免疫缺陷的婴幼儿更容易被感染。能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎，并可能引起神经功能紊乱，造成严重的后遗症和死亡。婴儿配方奶粉是其主要的传播途径，而且婴儿配方奶粉中微量的阪崎肠杆菌污染（<3CFU/100g）也能导致感染的发生。

目前对阪崎肠杆菌的检测方法主要有传统检测方法和分子检测方法。传统检测实验步骤繁琐，检出时间长达6～7d，而且可操作性差；随着分子生物学的发展，越来越多的分子检测技术用于阪崎肠杆菌的检测，如免疫学法和实时PCR。免疫学方法具有操作简单、实验成本低的特点，通过制备克隆抗体的方式对传统检测提供辅助，但具有易发生交叉反应的缺点，特异性和灵敏度均不理想；实时PCR方法敏感、快速，但由于需要昂贵的仪器设备以及对操作人员的专业水平要求高，使其难以在基层普及和推广。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是2000年日本荣研化学株式会的Notomi等开发的一种新的核酸扩增方法。LAMP法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA ploypolymerase）在恒温条件下（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点，可以在1小时之内，将靶DNA片段扩增10⁹～10¹⁰。因为LAMP技术是针对靶基因的6个区域设计两对引物进行扩增，所以比PCR具有更高的特异性，并且不需要温度改变，实验条件简单，有利于基层机构的现场检测。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于提供一种阪崎肠杆菌的LAMP引物组，根据阪崎肠杆菌的16SrRNA基因（ES16S）保守区序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.html）在线设计特异引物组，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现阪崎肠杆菌的快速检测，为阪崎肠杆菌检测提供了有效且快速的核酸筛查检测方法。

本发明的另一目的在于提供上述阪崎肠杆菌的LAMP检测试剂盒及使用方法。

一种阪崎肠杆菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

ES16S-F3:GTCACGTTTGAGATATTTGCTC，

ES16S-B3:AACGGTTCATATCACCTTACC；

ES16S-FIP: GTGCTGCGAGTTTGAGAGACTTTGAAACAGACATGCTGCT，

ES16S-BIP:TCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCCAGATTAGCACGTCCTTCAT；

ES16S-LF:CGCGCATTTCTTATTACGGAG，

ES16S-LB:CAAGCGTACACGGTGGAT。

上述阪崎肠杆菌的LAMP检测试剂盒，包括以下物质：（1）DNA聚合酶；（2）2×反应缓冲液；（3）荧光染料；（4）密封液；（5）标准阳性模板；（6）阴性对照；（7）上述的LAMP引物组。

在上述LAMP检测试剂盒中，所述LAMP引物组的浓度比例分别为：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。

在上述LAMP检测试剂盒中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶.

在上述LAMP检测试剂盒中，所述2×反应缓冲液包括buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs，三者的体积比为10：8：7。

在上述LAMP检测试剂盒中，所述荧光染料为浓度是0.02mM的SYTO-9。

在上述LAMP检测试剂盒中，所述密封液为矿物油。

在上述LAMP检测试剂盒中，所述的标准阳性模板为阪崎肠杆菌标准菌株基因组DNA；阴性对照为灭菌超纯水。

使用上述的LAMP试剂盒检测阪崎肠杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）待检样品的提取：采用水煮法从待检样品中提取DNA；

（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐至25μl；密封液加入体积为20μl，同时设置阳性对照和阴性对照；将配置好的PCR管混匀后离心，63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；

（3）检测结果判断：将上述反应管置于荧光PCR仪（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根据扩增曲线来判断检测结果，扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有阪崎肠杆菌；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有阪崎肠杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果

（1）本发明不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性，只需一恒定温度就能扩增反应。

（2）高特异性。本发明根据阪崎肠杆菌的16SrRNA基因（ES16S）保守区序列设计六条特异引物，对靶基因6个区域进行特异扩增，特异性强，且与其他菌株无交叉反应。

（3）快速、高效扩增，耗时短。扩增不需要加热变性，省去了热循环步骤，40～60min即可完成扩增反应。并且增加环引物的环介导等温扩增方法，使反应速度可提高1/2～1/3。

（4）鉴定简便。可通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

附图说明：

图1为LAMP灵敏性实验结果示意图；其中，从左至右依次为浓度1ng/μl、100pg/μl和10 pg/μl阪崎肠杆菌基因组DNA模板LAMP反应结果。

图2为LAMP特异性实验结果示意图；

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，但不应该当作对本发明的限制。

实施例1：一种阪崎肠杆菌的LAMP引物的设计合成和检测试剂盒的建立

（1）LAMP引物的设计合成

根据文献报道，以阪崎肠杆菌ES16S基因作为靶基因，采用引物设计软件Primer Explorer 4.0设计包括环引物在内的6条LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6条引物序列如下所示：

SEQ NO.1：ES16S-F3:GTCACGTTTGAGATATTTGCTC

SEQ NO.2：ES16S-B3:AACGGTTCATATCACCTTACC

SEQ NO.3：ES16S-FIP: GTGCTGCGAGTTTGAGAGACTTTGAAACAGACATGCTGCT

SEQ NO.4：ES16S-BIP:

TCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCCAGATTAGCACGTCCTTCAT

SEQ NO.5：ES16S-LF:CGCGCATTTCTTATTACGGAG

SEQ NO.6：ES16S-LB:CAAGCGTACACGGTGGAT

（2）阪崎肠杆菌LAMP检测试剂盒除包括上述LAMP引物组外，还包括DNA聚合酶、2×反应液、荧光染料、密封液、阳性对照和阴性对照。其中反应液包含buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs，各成分体积比为10：8：7。

（3）检测方法：

1）待检样品的提取：采用水煮法，将样品稀释液煮沸，上清液作为扩增反应DNA模板。

2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：ES16S -F3 0.2μM，ES16S -B3 0.2μM，ES16S -FIP 0.8μM，ES16S -BIP 0.8μM，ES16S -LF 0.4μM，ES16S -LB 0.4μM，2×反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，STO-9 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐至25μl。密封液加入体积为20μl。同时设置阳性对照和阴性对照。

将配置好的PCR管混匀后离心，63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。

3）检测结果判断：将上述反应管置于荧光PCR仪（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有阪崎肠杆菌；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有阪崎肠杆菌。

实施例2 LAMP灵敏度实验

将阪崎肠杆菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。应用Magen细菌基因DNA提取试剂盒提取培养产物中的细菌DNA。将阪崎肠杆菌标准菌株抽提的DNA进行10倍梯度稀释，分别以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照（灭菌超纯水）按照实施例1的反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒检测方法的灵敏性。

参见图1，结果表明：将阪崎肠杆菌基因组DNA进行10倍梯度稀释后，建立实施例1的阪崎肠杆菌LAMP检测试剂盒可检测样品中10pg/μl的阪崎肠杆菌DNA。

实施例3 LAMP特异性实验

应用实施例1的LAMP检测试剂盒对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、单细胞增生李斯特氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌及副溶血性弧菌进行检测，检测结果如图2所示。设置阪崎肠杆菌基因组DNA为阳性对照，灭菌超纯水为阴性对照。从图2中可以看出，只有阪崎肠杆菌出现阳性结果，其他菌株为阴性结果直至反应时间延长至60min。说明实施例1的LAMP反应体系只对阪崎肠杆菌有特异性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局，暨南大学，广州双螺旋基因技术有限公司

<120> 一种阪崎肠杆菌的LAMP引物组及试剂盒与使用方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列ES16S-F3

<400> 1

gtcacgtttg agatatttgc tc 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列ES16S-B3

<400> 2

aacggttcat atcaccttac c 21

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列ES16S-FIP

<400> 3

gtgctgcgag tttgagagac tttgaaacag acatgctgct 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列ES16S-BIP

<400> 4

tcttcgggtt gtgaggttaa gccagattag cacgtccttc at 42

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列ES16S-LF

<400> 5

cgcgcatttc ttattacgga g 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列ES16S-LB

<400> 6

caagcgtaca cggtggat 18