一种用于预示和鉴定鸭生长和腹脂率的分子标记方法及应用与流程

本发明属于水禽分子生物学技术领域，具体涉及一种用于预示和鉴定鸭生长和腹脂率的分子标记方法，该分子标记方法可应用于家鸭肉鸭新品系标记辅助选择育种。

背景技术：

我国是世界上养鸭最多的国家，据报道，我国鸭存栏量约占世界鸭存栏总量的60％，肉鸭年屠宰量占世界肉鸭屠宰总量的75％左右。肉鸭虽然其饲养量不及肉鸡，但在世界肉禽业中仍占有重要位置，近十年多来发展速度相当快，尤其是在中国、东南亚等发展中国家占有重要的地位。肉鸭同其它家禽一样具有高繁殖力、扩繁快的优势，育种已从原来本品种选育发展为商业配套系选育为主，国外培育的肉鸭配套系有英国的樱桃谷肉鸭、澳大利亚的的狄高肉鸭、美国的枫叶鸭、丹麦的海格肉鸭、丽佳肉鸭、法国的奥白星肉鸭、番鸭和日本的大阪肉鸭等。我国肉鸭品种改良、遗传育种工作起步较晚，科学系统的选育是从上世纪50年代以后才得到重视和开展。目前北京鸭选育已达到世界先进水平。我国肉鸭良种选育主要采用常规的育种方法结合分子育种的方法，即在通过闭锁群家系育种辅以DNA分子标记技术进行选择培育具有某个目标性状的肉鸭新品系。当前DNA分子标记技术在家禽遗传育种中的应用主要体现在遗传多样性分析、种质鉴定、亲缘关系研究遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助育种等方面。针对肉鸭目标性状的新品系选育主要集中在生长速度、饲料利用率、胴体品质和繁殖性能等方面。生长速度遗传力高且容易度量，因此个体选择的效果较好。但如果只注重生长速度选择的结果，在促进肉鸭快速生长的同时，容易出现脂肪沉积过多，降低饲料利用率并影响胴体品质。肉鸭的胴体品质主要目标是增加胸腿肉产量和降低胴体脂肪。因此降低肉鸭脂肪沉积，培育低脂瘦肉品系已是重要的育种内容。随着分子生物学技术的发展，人们可以通过寻找控制脂肪沉积的主基因或与其连锁的分子标记，从而通过分子标记实施早期选择及间接选择。目前，尽管在鸭脂肪沉积候选基因鉴定和应用方面取得了一些进展，但能够真正能用于选择低腹脂率进行育种实践的很有限，因此非常有必要寻找有效的能够影响鸭脂肪沉积的候选基因及分子标记。

极低密度脂蛋白受体(VLDLR)是一种细胞膜表面的蛋白质，由846个氨基酸组成，是含ApoE的脂蛋白颗粒等多种不同配体的受体。极低密度脂蛋白受体有着5个功能结构域：配体结合结构域、表皮生长因子前体结构域、含糖基结构域、跨膜结构域和胞内结构域。它主要负责结合和内移含载脂蛋白，如极低密度脂蛋白(VLDL)，向肝外组织提供甘油三酯作为能量来源。许多研究表明，极低密度脂蛋白受体在脂肪酸代谢活跃的组织，如心脏、骨骼肌和脂肪组织中含量丰富，而且能够选择性地和载脂蛋白E、富含甘油三酯的脂蛋白结合。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)是脂肪沉积候选基因中一个中央节点(central nodes)，研究显示PPARα可调节VLDLR基因的表达。有关VLDLR的研究大都集中在人和鼠，研究发现VLDLR与肥胖及体重相关，人VLDLR基因的突变还会导致血脂代谢紊乱，而血脂异常与动脉粥样硬化密切相关，属心脑血管疾病，因此受到了广泛关注和深入研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于预示和鉴定鸭生长和腹脂率的分子标记方法及应用。本发明以高邮鸭保种场纯品系鸭为实验对象，通过PCR测序方法检测VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区的多态性，并分析不同基因型与生长性状和腹脂率的相关性，以期发现新的核甘酸多态性(SNPs)位点和能影响生长和脂肪沉积的有效分子标记信息，选育生长速度快、腹脂率低的肉用家鸭，为培育优质的肉鸭品系奠定基础。

实现本发明目的的技术方案是：

一种用于预示和鉴定鸭生长和腹脂率的分子标记方法，包括以下步骤：

以包含VLDLR基因的待测鸭全基因组DNA为模板，用Primer5.0设计引物，扩增长度为374bp，上下游引物序列为：

上游5’-ATTACACTGCCAAATGACC-3’；

下游5’-CGGGAACTGGGATTCTTC-3’；

产物经琼脂糖凝胶电泳检测后进行纯化双向测序，测序鉴定家鸭VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区多态性。对VLDLR基因单倍型组合与生长速度和腹脂率之间进行关联分析，发现能影响生长速度和腹脂率的有效分子标记信息，从而辅助分子标记培育出优质肉鸭品系。

进一步，所述PCR扩增反应体系为25μL，反应程序为94℃预变性10min，然后35个循环(94℃变性30S，53.5℃退火30S，72℃延伸30S)，72℃延伸10min，4℃保存。

进一步，所述纯化双向测序是以PCR反应的引物作为测序引物，和PCR产物进行纯化测序，使用PHASE软件统计SNP位点的单倍型、单倍型频率及构建单倍型组合。

测序结果与NCBI序列(HQ446852.1)进行比对分析，得到4个多态位点及其分型情况：

在g.151位点，GA基因型的频率最高，为0.56，AA基因型的频率最低，为0.04，等位基因频率G>A；

在g.170位点，CC基因型的频率最高，为0.50，CT基因型的频率最低，为0.22，等位基因频率C>T；

在g.206位点，AG基因型的频率最高，为0.50，GG基因型的频率最低，为0.17，等位基因频率A>G；

在g.278-295位点，DD型的频率最高，为0.65，DB型的频率最低，为0.11，等位基因频率D>B。

采用PHASE2.0软件，对4个多态位点构建了单倍型、双倍型。4个多态位点共构建了8种单倍型，分别为H1(GTAB)、H2(ATAD)、H3(GTGD)、H4(GCAD)、H5(GCGD)、H6(ATGD)、H7(ACAD)、H8(ACGD)。其中H8(A-C-G-D)为最主要单倍型，频率高达29.81％，H3(GTGD)和H7(ACAD)单倍型频率最低，均为0.96％。基于8个单倍型构建了15个双倍型，H4H8频率最高，为28.16％。在15个双倍型中，除H1H1、H5H8、H2H8、H4H8以外其余双倍型的频率均低于5％，因此不进行相关分析。

本发明所述的与鸭生长及脂肪相关的VLDLR基因分子标记可以应用于鸭标记辅助选择育种中。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

(1)在鸭身上证实了VLDLR的多态性和生长及脂肪沉积有关。

(2)通过对鸭VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区多态性与生长及腹脂率进行关联性分析，对培育出优质肉鸭品系奠定了基础。

附图说明

图1是鸭VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区扩增片段结果。

图2是鸭VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区的多态位点基因型图谱。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过具体的实施例来具体说明本发明的技术方案。

实施例1

1实验材料与方法

1.1实验动物

试验用鸭为高邮鸭，在高邮鸭繁育基地统一孵化、出雏，共267只。按常规方法对试验鸭进行饲养管理和免疫，地面平养至第10周，饲养期有水池和活动场地。

1.2生长性能测定

分别于0、3、4、5、6、7、8、9、10周龄，每周龄第一天早上空腹称重，记录高邮鸭的周龄体重，于饲养第10周，活体翅静脉抽取高邮鸭的血样抗凝后保存，测定活体重后进行屠宰，测定屠体性能指标。屠宰测定按照全国家禽育种委员会统一标准进行，测定全净膛重、半净膛和腹脂重，并计算腹脂率。腹脂率＝腹脂重/(全净膛重+腹脂重)。

1.3DNA提取

用常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。用微量紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，其A260/A280须在1.6～1.9之间。

1.4PCR扩增

根据Genbank中发表的鸭VLDLR基因序列，用Primer5.0设计引物，扩增长度为374bp，扩增片段包含了VLDLR基因5’UTR和全部信号肽区域。

上下游引物序列为：

上游5’-ATTACACTGCCAAATGACC-3’

下游5’-CGGGAACTGGGATTCTTC-3’

PCR扩增反应体系为25μL，反应程序为94℃预变性10min，然后35个循环(94℃变性30S，53.5℃退火30S，72℃延伸30S)，72℃延伸10min，4℃保存。

1.5测序和多态性检测

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳及Goldview染色后在凝胶成像仪上检测，将产量高、特异性好的PCR产物经送华大基因有限公司进行纯化双向测序；利用DNAMAN软件结合测序图对测序结果进行多态性检测分析从而准确确定SNPs。

1.6统计方法

计算等位基因频率，采用卡方检验等位基因Hardy-Weinberg equilibrium平衡。

根据腹脂率及供试鸭群的特点，建立线性回归模型：Y＝μ+G+e，其中：Y为性状的测定值；μ为群体均值；G为基因型效应；e为随即残差。

采用PHASE2.0软件对单倍型和双倍型进行构建并计算其频率的大小。

采用Popgen32、PIC_CALC软件对遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)及多态信息含量(PIC)进行计算。

统计分析采用SPSS15.0软件，各基因型的体重和腹脂率用平均数±标准误表示。

SNPs位点的连锁不平衡分析采用SHEsis软件进行分析并计算出r2。

2结果与分析

2.1扩增结果

用所设计的引物对高邮鸭基因组DNA进行PCR扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在500bp-250bp之间出现一条清晰的条带，与预期片段大小(374bp)一致，且没有非特异性扩增，结果见图1。

2.2计算等位基因频率

VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区的4个多态位点的基因型频率及等位基因频率见表1。从表1中可看出在g.151位点，GA基因型的频率最高，等位基因频率G>A；在g.170位点，CC基因型的频率最高，等位基因频率C>T；在g.206位点，AG基因型的频率最高，等位基因频率A>G；在g.278-295位点，DD型的频率最高，等位基因频率D>B。遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)及多态信息含量(PIC)是反映群体遗传特性的重要参数。从表1中可看出，g.206位点的He(遗传杂合度)和Ne(有效等位基因数)最高，分别为0.49和1.95，g.278-295位点的He(遗传杂合度)和Ne(有效等位基因数)最低，为0.42和1.71；g.206位点的PIC(多态信息含量)最高，为0.37，g.278-295位点最低，为0.33。经卡方检验，除g.206位点符合Hardy-Weinberg遗传平衡状态外(p＞0.05)，其余三个位点均不符合Hardy-Weinberg遗传平衡状态(p＜0.05)。

表1高邮鸭群VLDLR基因5'UTR和信号肽编码区基因频率和平衡检验(n＝267)

基因型频率中表示方式：频率/个数(基因型)；等位基因频率中表示方式：等位基因频率(等位基因)

2.3单倍型、双倍型构建及其频率

采用PHASE2.0软件，对4个多态位点构建了单倍型、双倍型，并分析了相应频率，结果见表2和表3。4个多态位点共构建了8种单倍型，分别为H1(GTAB)、H2(ATAD)、H3(GTGD)、H4(GCAD)、H5(GCGD)、H6(ATGD)、H7(ACAD)、H8(ACGD)。其中H8(A-C-G-D)为最主要单倍型，频率高达29.81％，H3(GTGD)和H7(ACAD)单倍型频率最低，均为0.96％。基于8个单倍型构建了15个双倍型，H4H8频率最高，为28.16％。在15个双倍型中，除H1H1、H5H8、H2H8、H4H8以外其余双倍型的频率均低于5％，不进行相关性分析。

表2 4个多态性位点的单倍型及其频率

表3 4个多态性位点的部分双倍型及其频率

2.4双倍型对生长性能及腹脂率的分析

表4列出了部分有显著或极显著差异的单倍型组合与生长性状及腹脂率的相关性。

由表4可看出，在0至5周龄，各双倍型的体重均无显著差异(P＞0.05)；在6周龄，H1H1双倍型的体重最高，H2H8双倍型的体重最低，两者之间差异显著(P＜0.05)；在7至10周龄，H1H1双倍型的体重最高并极显著高于H2H8双倍型(P＜0.01)同时显著高于H4H8双倍型(P＜0.05)，而H2H8双倍型与H4H8双倍型的体重之间无显著性的差异(P＞0.05)。对于屠宰率、半净膛率和全净膛率，各双倍型均无显著性差异，而相对于腹脂率来说，H5H8型的腹脂率极显著高于H1H1双倍型和H2H8双倍型(P＜0.01)，显著高于H4H8双倍型(P＜0.05)，H4H8双倍型的腹脂率显著高于H1H1双倍型(P＜0.05)，H1H1双倍型和H2H8双倍型之间差异不显著(P＞0.05)。最小二乘法分析结果表明，H1H1双倍型的平均体重最高，H2H8双倍型最低；H5H8双倍型的腹脂率最高，H4H8双倍型次之，H1H1双倍型最低。双倍型H1H1对体重有正向作用，H5H8双倍型对腹脂率有正向作用，可以用作选择肉鸭新品系的辅助分子标记。

表4 4个SNP位点双倍型与生长性状及腹脂率的关联分析