本发明属于蔬菜分子生物技术领域，具体涉及与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点及其检测方法和引物组。
背景技术：
花椰菜是我国重要的蔬菜作物之一，也是我国主要的出口创汇蔬菜之一，其种植区域几乎覆盖全国各地。据联合国粮食及农业组织（FAO）和美国农业部（USDA）统计，我国花椰菜种植面积和总产量均列世界第一位，近年来分别稳定在每年40 万公顷和900 万吨以上，其中年出口创汇额约1 亿美元。
花椰菜的商品器官花球是由许多短缩蕾枝和花序分生组织共同构成的表面较为圆整、光滑的球体。而在花椰菜生产中，花球表面经常会出现大量发育中的毛状花蕾，这种现象称为“毛花”。毛花对花球质量和产量影响很大，严重时会造成花球商品性完全丧失，是花椰菜产业面临的最严重问题之一。尽管环境因素（尤其是温度）对毛花现象的影响不容忽视，但不同品种/基因型间在耐/易毛花方面存在显著的差异，暗示着该性状是可遗传的。以往研究表明，毛花性状具有较高的遗传力和显著的选择效应，而环境效应则非常有限。因而毛花性状的遗传改良也是长期以来花椰菜育种的重要课题之一。因此，通过鉴定与花球毛花性状相关的序列变异，开发与之紧密连锁的分子标记及实用性强的检测方法，并应用于品种选育中，可大大缩短育种周期，提高育种效率。
技术实现要素：
针对花椰菜传统育种中对花球毛花性状的选择效率不高、环境和经验依赖性强的问题，本发明的第一个目的是提供一种与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点，用于花椰菜花球耐毛花分子标记辅助育种。本发明的第二个目的是提供一种上述的与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点的检测方法，该方法快捷、稳定。本发明的第二个目的是提供一种检测上述的与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点的特异引物组合。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点，其特征在于：对应的花球性状为耐毛花，该位点及其侧翼序列为5’-CCAAAACAAAAGTGCAAAATCTTATATATGCGCGCGGCTT GTATGTATTTATGTGATTTTTTCAAATGTAAACGTGTTTA-3’； 对应的花球性状为易毛花，该位点及其侧翼序列为5’-CCAAAACAAAAGTGCAAAATCTT ATATATGCACGCGGCTTGTATGTATTTATGTGATTTTTTCAAATGTAAACGTGTTTA-3’。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点的检测方法，该方法包括以下的在步骤：
1）待检测花椰菜基因组DNA提取：将待检测花椰菜材料按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用；
2）待检测样品基因组DNA的PCR扩增：利用特异引物组合对待检测样品的基因组DNA分别进行PCR扩增，特异引物组合中上游引物：5’- CCAAAACAAAAGTGCAAAATCT -3’;下游引物 :5'- AAGGCCCTATTGGTA ACTTG -3’；反应总体积20μL，具体体系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×扩增缓冲液，基因组DNA 50 ng，加dd H2O至20μL；热循环程序为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
3）PCR产物的酶切反应及电泳检测：将2）中的PCR产物利用限制性内切酶BseP I在50℃条件下酶切3 h，酶切体系含 PCR 产物 7μL， 10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H2O至10μL；酶切后将其产物在1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭显色；
4）待检测样品基因型的鉴定：依据3）中凝胶条带模式，显示160 bp的样品为含有易毛花基因型的材料，对应的花球性状为易毛花；而显示128 bp的样品则为含有耐毛花基因型的材料；对应的花球性状为耐毛花。
本发明的第三个目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种检测所述的与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点的特异引物组合，该特异引物组合中上游引物：5’- CCAAAACAAAAGTGCAAAATCT -3’;下游引物 :5'- AAGGCCCTATTGGTA ACTTG -3’。
本发明的有益效果是：
（1）本发明提供的与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点及其检测方法可应用于花球毛花性状的辅助选择，检测方便,费用低廉。利用本方法在苗期即可对育种材料进行检测，从而可在早期淘汰大量含有易毛花基因型的材料，大幅度减少后期所需的定植、田间管理、表型鉴定的工作量。另外，本发明中的标记是基于SNP开发而来，这为今后实现高通量的自动化基因型检测提供了可能。
（2）传统育种方法完全依赖于对花球毛花性状的表型调查进行选择。而易毛花对耐毛花为显性，表型为易毛花的个体并不代表不携带有耐毛花基因位点，因此利用表型选择耐毛花时往往需要额外自交一代，需耗费大量时间。利用本方法可针对相应位点的基因型进行鉴定，直接确定样品中是否含有耐毛花基因型。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：（花椰菜种质资源耐毛花位点的基因型鉴定）
（1）将花椰菜种质资源播种、育苗、分单株编号。于2-3片真叶期取各单株叶片按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用。
（2）利用特异引物组合（上游引物：5’- CCAAAACAAAAGTGCAAAATCT -3’;下游引物 :5'- AAGGCCCTATTGGTA ACTTG -3’）对（1）中的DNA样品分别进行PCR扩增。反应总体积20μL，具体体系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×扩增缓冲液，基因组DNA 50 ng，加dd H2O至20μL。热循环程序为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
（3）将（2）中的PCR产物利用限制性内切酶BsePI在50℃条件下酶切3 h，酶切体系含 PCR 产物 7μL， 10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H2O至10μL。酶切后将其产物在1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭显色。
（4）依据（3）中凝胶条带模式，显示128 bp的样品则为含有耐毛花基因型的材料。在这些资源中选择其他农艺性状好的进行连续自交和筛选，获得了一批耐毛花且农艺性状优异的育种材料。
实施例2：（花椰菜自交系‘4251’毛花性状的分子标记辅助改良）
花椰菜自交系‘4251’农艺性状优异，但花球在某些环境下易毛花，需要利用花球不易毛花的自交系‘4229’对其进行定向遗传改良。本发明中的特异分子标记扩增产物在二者间存在160bp/128bp的多态性，因此可利用本发明在回交过程中进行分子标记辅助选择。
（1）‘4229’和‘4251’的杂交和回交：将‘4229’和‘4251’种子分别播种、育苗、定植于塑料大棚。以‘4229’为父本，‘4251’为母本开花期进行人工播蕾杂交，待种荚成熟后收集种子，即为F1。次年将F1种子和轮回亲本‘4251’种子分别播种、育苗、定植于塑料大棚。以F1为父本，‘4251’为母本开花期进行人工播蕾杂交，待种荚成熟后收集种子（200粒以上），即为BC1F1。
（2）BC1F1世代苗期分子标记辅助选择：将收集的BC1F1世代种子随机选取200粒，穴盘播种，育苗，并分单株编号。于2-3片真叶期取各单株叶片按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用。利用特异引物组合（上游引物：5’- CCAAAACAAAAGTGCAAAATCT -3’;下游引物 :5'- AAGGCCCTATTGGTAACTTG -3’）对上述DNA分别进行PCR扩增。反应总体积20μL，具体体系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×扩增缓冲液，基因组DNA 50 ng，加dd H2O至20μL。热循环程序为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将PCR产物利用限制性内切酶BsePI在50℃条件下酶切3 h，酶切体系含 PCR 产物 7μL， 10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H2O至10μL。酶切后将其产物在1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭显色。在该BC1F1世代中，显示为128 bp的单株视为含有耐毛花位点基因型的材料予以保留，而显示为160 bp的单株则视为含有易毛花位点基因型的材料予以淘汰。在入选的单株中选择其它农艺、经济性状最接近轮回亲本‘4251’的植株与轮回亲本‘4251’杂交，获得BC2F1世代。
（3）后续回交世代的选择：对获得的BC2F1世代按照上述第（2）、（3）步骤进行选择，进而回交获得BC3F1世代；并以同样方法进行选择和回交直至BC6F1世代，再对其进行自交，获得遗传稳定的BC6F2世代，从中筛选耐毛花位点纯合的个体，即为毛花性状得到明显改良的‘4251’。
<110>浙江省农业科学院
<120>一种与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP位点及其检测方法和引物组
<160>4
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>花椰菜
<400>1
CCAAAACAAA AGTGCAAAAT CTTATATATG CGCGCGGCTT GTATGTATTT ATGTGATTTT 60
TTCAAATGTA AACGTGTTTA 80
<210>2
<211>80
<212>DNA
<213>花椰菜
<400>2
CCAAAACAAA AGTGCAAAAT CTTATATATG CACGCGGCTT GTATGTATTT ATGTGATTTT 60
TTCAAATGTA AACGTGTTTA 80
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CCAAAACAAA AGTGCAAAAT CT 22
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
AAGGCCCTAT TGGTAACTTG 20