同时快速恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法、引物及试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时快速恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术：

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是常在海洋食品中发现的两种革兰氏阴性致病菌，可引起原发性败血症、创伤感染、急性胃肠炎和霍乱等病症。因此，对于这两种食源性致病菌的预防和检测非常重要。

传统创伤弧菌和霍乱弧菌检测方法由于检测周期较长，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展，研究人员也开发出了PCR等检测手段，但是该方法需要专门的检测仪器，因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的创伤弧菌和霍乱弧菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。

目前有针对两种致病菌(如创伤弧菌和霍乱弧菌)分别设计引物，对这两种致病菌分别进行LAMP检测的方法，但还未见采用一套LAMP引物同时对两种致病菌进行检测的方法和例子。因此，行业内亟需一种能够同时快速恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的一套引物仅能检测一种致病菌的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性同时识别创伤弧菌和霍乱弧菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行创伤弧菌和霍乱弧菌LAMP引物的设计，提供了一种同时快速恒温扩增检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法、引物组及试剂盒。采用本发明的检测方法同时检测创伤弧菌和霍乱弧菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。

本发明提出一种同时快速检测创伤弧菌和霍乱弧菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从待测样品中提取基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组共有特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；

(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在创伤弧菌和/或霍乱弧菌。

本发明同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以创伤弧菌和霍乱弧菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在创伤弧菌和/或霍乱弧菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。

本发明中，所述创伤弧菌和霍乱弧菌基因组共有特异性碱基序列为GI号为320154846的创伤弧菌基因组2698869～2699116bp位和GI号为147673035的霍乱弧菌基因组216343～216590bp位序列。

本发明中，所述能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组共有特异性碱基序列的引物组为GI号为320154846的创伤弧菌基因组2698869～2699116bp位和GI号为147673035的霍乱弧菌基因组216343～216590bp位核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述创伤弧菌和霍乱弧菌基因组共有特异性碱基序列是指仅为创伤弧菌和霍乱弧菌基因组所共有且特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。

其中，所述能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于引物组A，或与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为68.4％及以上的引物组。

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-CGAGACTTGTGACGAGCTG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-TCCAAGCTGAGAAACGTCG-3’(SEQ ID NO：2)；

上游内引物FIP_A：5’-TGCAACTGCTGCATTCGCTGTATAAGGCCTTTAGTCGCCATG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游内引物BIP_A：5’-CCAGCAGCGATTGCAGCAACACAATGCTAGCCGTCGTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

本发明中，所述能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为68.4％及以上的引物组，该引物组包括但不限于以下引物组B：

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-CGAGACTTGTGACGAGCTG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GCGCTATCCAAGCTGAGAA-3’(SEQ ID NO：6)(与引物B3_A5’-TCCAAGCTGAGAAACGTCG-3’同源性为68.4％)；

上游内引物FIP_B：5’-TGCAACTGCTGCATTCGCTGTATAAGGCCTTTAGTCGCCATG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游内引物BIP_B：5’-CCAGCAGCGATTGCAGCAACACAATGCTAGCCGTCGTTC-3’(SEQ ID NO：8)。

本发明方法中，在一具体实施方案中，所述恒温扩增的酶反应体系为：1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜碱。例如，1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO₄和酶反应体系中的镁离子Mg²⁺做合并处理。

本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90min，优选地为10～60min；②80℃终止反应2～20min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。

本发明方法中，检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测，优选为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。电泳检测结果中，如电泳图呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈阳性，含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌；如电泳图不呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈阴性，不含创伤弧菌和霍乱弧菌。所述浊度检测，是用肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现明显混浊，则待测样品呈阳性，含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌；如未见混浊，则待测样品为阴性，不含创伤弧菌和霍乱弧菌。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈阳性，含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈阴性，不含创伤弧菌和霍乱弧菌。

所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限于钙黄绿素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羟基萘酚蓝(即HNB，120-150μM)。当采用钙黄绿素或SYBR Green I作为显色剂时，如反应后颜色为橙色，则待测样品为阴性，不含创伤弧菌和霍乱弧菌；如反应后颜色为绿色，则待测样品为阳性，含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌。当采用羟基萘酚蓝作为显色剂时，如反应后颜色为紫罗兰色，则待测样品为阴性，不含创伤弧菌和霍乱弧菌；如反应后颜色为天蓝色，则待测样品为阳性，含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌。所述显色检测，除了上述通过肉眼观察反应结果外，也可以通过检测仪器进行实时或终点检测反应结果，通过合理的设定阴性反应的阈值，当待测样品反应的结果低于或等于该阈值时，则待测样品为阴性，不含创伤弧菌和霍乱弧菌；当待测样品反应的结果大于该阈值时，则待测样品为阳性，含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌。所述检测仪器包括但不限于荧光分光光度计、荧光定量PCR仪、恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和Genie II等温扩增荧光检测系统等。

所述显色检测中，若采用钙黄绿素或羟基萘酚蓝作为显色剂，可以在恒温扩增反应之前加入，也可以在恒温扩增反应完成之后加入，优选地为恒温扩增反应之前加入，可以有效的减少反应污染的可能性。若采用SYBR Green I作为显色剂，则在恒温扩增反应完成之后加入。若采用钙黄绿素作为显色剂，则在酶反应体系中加入50μM钙黄绿素的同时，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本发明还提供了用于同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组特异碱基序列的引物组，其包括但不限于，所述引物的序列为GI号为320154846的创伤弧菌基因组的2698869～2699116bp位和GI号为147673035的霍乱弧菌基因组的216343～216590bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。

其中，所述能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组共有特异性碱基序列的引物组选自以下各引物组之任意一组，或选自与所述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为68.4％及以上的任一引物组。其中，所述引物组包括但不限于以下引物组A。所述与前述引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为68.4％及以上的引物组包括但不限于以下引物组B。

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-CGAGACTTGTGACGAGCTG-3’；

下游外引物B3_A：5’-TCCAAGCTGAGAAACGTCG-3’；

上游内引物FIP_A：5’-TGCAACTGCTGCATTCGCTGTATAAGGCCTTTAGTCGCCATG-3’；

下游内引物BIP_A：5’-CCAGCAGCGATTGCAGCAACACAATGCTAGCCGTCGTTC-3’；

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-CGAGACTTGTGACGAGCTG-3’；

下游外引物B3_B：5’-GCGCTATCCAAGCTGAGAA-3’；

上游内引物FIP_B：5’-TGCAACTGCTGCATTCGCTGTATAAGGCCTTTAGTCGCCATG-3’；

下游内引物BIP_B：5’-CCAGCAGCGATTGCAGCAACACAATGCTAGCCGTCGTTC-3’。

本发明还提供一种用于上述同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌菌株方法中的试剂盒，其包括所述能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组特异碱基序列的引物组。本发明试剂盒中，所述能扩增创伤弧菌和霍乱弧菌基因组共有特异性碱基序列的引物组，包括但不限于以GI号为320154846的创伤弧菌基因组2698869～2699116bp位和GI号为147673035基因组216343～216590bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分作为所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物组A。还包括但不限于以与前述引物序列或其互补链序列中单条序列同源性为68.4％及以上的引物组作为引物；包括但不限于引物组B。

本发明试剂盒中，还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜碱中的一种或多种。在一具体实施方案中，本发明试剂盒酶反应体系包含1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜碱。例如，1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO₄和酶反应体系中的镁离子Mg²⁺做合并处理。

本发明试剂盒中，还包含阳性对照模板。在一具体实施方案中，所述阳性对照模板包括但不限于创伤弧菌和/或霍乱弧菌的全基因组DNA、部分基因组DNA，或包含创伤弧菌和/或霍乱弧菌全基因组DNA或部分基因组DNA的载体，两种病原菌基因组DNA可以混合在一起，也可以分别独立包装。

本发明试剂盒中，还包含阴性对照模板，所述阴性对照模板包括但不限于双蒸水。

本发明试剂盒中，还包含显色剂，显色剂包括但不限于钙黄绿素，SYBR Green I或羟基萘酚蓝。当显色剂为钙黄绿素时，试剂盒中还包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本发明试剂盒中，还包含双蒸水。

本发明试剂盒中，还包含核酸抽提试剂。

本发明还提出了一种载体，所述载体包含选自引物组A、B之任意一组引物。该载体由于包含了具有创伤弧菌和霍乱弧菌的共有的特异性的DNA序列，因此可应用于微生物分类学、比较基因组学、进化等研究领域，以及微生物检测等应用领域。该载体可以是但不限于质粒载体(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti质粒等)、病毒载体(如λ噬菌体等)和人造染色体载体(如细菌人造染色体BAC、酵母人造染色体YAC等)。例如，包含引物组A之任意一条引物的载体pBR322-A、包含引物组B之任意一条引物的载体pBR322-B等。包含引物组A之任意一条引物的载体λ噬菌体-A、包含引物组B之任意一条引物的载体λ噬菌体-B等。

本发明还提出了选自引物组A、B之任意一组的引物在同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌中的应用。

本发明还提出了所述试剂盒在同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌中的应用。

本发明还提出了所述载体在同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌中的应用。

本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的同时检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法、引物/引物组、检测试剂/试剂盒，对我国的食品安全具有较大意义。本发明有益效果包括：采用本发明创伤弧菌和霍乱弧菌检测方法具有一次反应可以同时检测两种致病菌，特异性强、灵敏度高、检测时间短、结果判定简单、操作便捷、成本低等优点。与目前常用检测方法相比，本发明采用的恒温扩增法，可以在恒温条件下进行，只需采用简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，不需要对扩增产物进行电泳检测等步骤，因而，非常适于广泛应用于社会各界包括基层食品安全检测部门推广使用，即使在分子生物学专业知识和技能基础相对不足的环境下也可充分应用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。

附图说明

图1表明本发明实施例7创伤弧菌和霍乱弧菌恒温检测方法的特异性。

图2表明本发明实施例8创伤弧菌和霍乱弧菌检测方法的灵敏度。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1-6创伤弧菌和霍乱弧菌恒温反应体系和检测方法

按照以下(1)～(3)步骤进行检测：

(1)基因组DNA的提取

用于检测的创伤弧菌菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC10383(＝ATCC27562)，霍乱弧菌菌种来源于中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC 1.8676。取1mL细菌培养物使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8～2.0，浓度分别为210.8ng/μL和30.4ng/μL。

(2)以待测创伤弧菌和霍乱弧菌基因组DNA为模板，分别采用自配的试剂盒(见表1，表2)，并按照表2中所述条件，配制反应体系，以创伤弧菌和霍乱弧菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应。实施例1～6中的引物分别为引物组A，A，A，B，B，B。

(3)按照表2中所述条件，通过电泳检测、浊度检测或显色检测，进行扩增结果确认。

由表2可以看出，本发明检测方法及其所采用的引物组及反应体系能够很好地对创伤弧菌和霍乱弧菌共有特异性片段进行扩增并得到检测结果。因此，本发明可以应用于检测样本中是否含有创伤弧菌和/或霍乱弧菌。

实施例7创伤弧菌和霍乱弧菌特异性检测

收集非创伤弧菌和霍乱弧菌28株(表3和图1中的1～25，27～28和30)，将这些菌株与创伤弧菌和霍乱弧菌菌株(表3中的26和29)分别进行培养，取1mL菌液，采用试剂盒IA，提取细菌DNA，并参照实施例1的反应体系和条件，分别进行LAMP扩增(引物组为A)和加入显色剂观察。

其检测结果如表3和图1所示，图1中，1～25分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、表皮葡萄球菌、马红球菌，蕈样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、肠沙门氏菌肠亚种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、27～28分别为副溶血弧菌和弗氏弧菌，30为宋氏志贺氏菌，NTC：阴性对照，P为26和29号菌株DNA的混合液(26号和29号分别为创伤弧菌和霍乱弧菌)，即创伤弧菌和霍乱弧菌的混合样品。图1中，仅有含创伤弧菌和霍乱弧菌的混合样品管扩增反应后的产物呈现为亮绿色，为阳性结果，如P号管所示。而其他非创伤弧菌和霍乱弧菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物均呈现为橙色，为阴性结果，如第1～25号、27～28号管和30号管以及NTC阴性对照管所示。

由图1和表3结果可以看出，本发明检测试剂盒及检测方法具有良好的创伤弧菌和霍乱弧菌菌株特异性，即，只有创伤弧菌和霍乱弧菌菌株扩增阳性，其他非创伤弧菌和霍乱弧菌菌株为阴性。

配制检测试剂盒，试剂盒中采用的引物为引物组B，按上述特异性检测方法，得到同样的检测结果，即，非创伤弧菌和霍乱弧菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物为阴性结果，创伤弧菌和霍乱弧菌菌株扩增反应后的产物为阳性结果。

此外，分别对引物组A～B的特异性进行理论分析，方法是将引物F3和B3间的序列与GenBank数据库中的创伤弧菌和/或霍乱弧菌的基因组进行Bowtie比对，确定检测区域，然后将检测区域序列在公共数据库资源中的非创伤弧菌和霍乱弧菌进行Blast比对，检测引物区域与基因组序列匹配程度。若匹配程度越高，则特异性越差；若引物不能同时比对到非检测菌种菌株上，表明特异性好。结果发现，在各条引物最多允许三个错配的情况下，各引物组最多同时有6条引物比对到非创伤弧菌和霍乱弧菌上，为弗氏弧菌(Vibrio furnissii，GI＝375129161)，但在其引物区有较多错配(B3、F2、F1c各有两个错配，F3、B2、B1c各有一个错配)，表明各引物组的特异性均较好。

实施例8灵敏度检测

按实施例2的方法提取细菌CICC10383(创伤弧菌)和CGMCC1.8676(霍乱弧菌)的DNA，采用试剂盒IIB，并按照0.5fg、5fg、50fg和500fg DNA梯度分别加入反应体系，其他反应条件参照表2实施例2的方法分别进行LAMP扩增(引物组为A)和加入显色剂观察。如图2所示，1-4分别为0.5fg、5fg、50fg和500fg，NTC：阴性对照。图2中以创伤弧菌DNA为模板的处理，0.5fg、5fg、50fg和500fg处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，阴性对照的反应产物呈现为橙色，为阴性结果；以霍乱弧菌DNA为模板的处理，5fg、50fg和500fg处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，0.5fg和阴性对照的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含0.5fg～5fg(相当于1个细菌)的DNA时可被检出，灵敏度较高。

按上述检测方法，其他步骤及条件同上，用引物组B，每个反应管中低至5fg的DNA可被检出，检测灵敏度较高。

实施例8通用性检测

分别对引物组A～B的通用性进行理论分析，方法是将引物F3和B3间的序列与GenBank数据库中的创伤弧菌和/或霍乱弧菌的基因组进行Bowtie比对，确定检测区域，然后将检测区域序列在公共数据库资源中的创伤弧菌(3个基因组)和霍乱弧菌(8个基因组)进行Blast比对，检测引物区域与基因组序列的匹配程度，若引物区域完全匹配，则通用性好。结果发现，各引物组的引物区域与上述创伤弧菌和霍乱弧菌的11个基因组完全匹配，表明各引物组的通用性均较好。

表1同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌的试剂盒种类及主要组成成分

表2实施例1-6本发明同时恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法中的反应条件及检测结果

表3试验所用菌株及检测结果

注：a)CGMCC：中国普通微生物菌种保藏中心，CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心，CMCC：中国医学细菌菌种保藏管理中心。b)+：阳性结果，-：阴性结果。c)所用DNA模板为26和29号菌株DNA的混合液(1：1)。