专利名称：检测b亚群禽白血病的环介导等温扩增反应引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及环介导等温扩增反应引物，尤其涉及检测B亚群禽白血病的环介导等 温扩增反应引物，属于B亚群禽白血病的检测领域。
背景技术：
B亚群禽白血病由B亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus-B,ALV-B)引起， 主要造成淋巴细胞性白血病和肉瘤。20世纪70年代，Graf等和Kawai等分别报道过B亚群 禽白血病。1987年以后，国际大型种鸡公司已基本实现了 ALV净化，此后少有B亚群白血病 的病例报道。但2000年以后，又出现了 B亚群自然感染的报道。Spencer等从商品鸡群中同 时检测到ALV-A和ALV-B。Gingerich等在白来航鸡群中发现J和B亚群的重组病毒，该病 毒的LTR为J，囊膜基因为B。Mays等也报道了相似类型的B/J亚群重组病毒。Lupiani等 在观测到髓细胞增生表现的商品蛋鸡群中分离到一株重组病毒，该病毒具有B亚群的gp85 区段，E亚群的gp37区段和J亚群的LTR。B亚群的再次流行以及与其它亚群的共感染或 重组现象值得科研人员关注。但目前对B亚群的分型检测方法相对较少，商品化的抗体检 测试剂盒不能与A亚群区分。对B亚群病毒抗原的检测主要是利用PCR方法，扩增gp85的 特异性区段。因此，建立B亚群的分型检测方法十分必要。2000年日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温 扩增反应(LAMP)，其特点是针对靶基因的6 (或8)个区域设计4(或6)种特异引物，利用链 置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65°C左右)保温几十分钟，即可完成 核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，基因 的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15-60min扩增IO9-IOltl倍，具有不需要 特殊仪器、快速、特异性强的特点，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核 酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判 定。采用LAMP方法鉴别检测B亚群禽白血病的前提和关键是需要根据禽白血病亚群 间序列特征，设计得到B亚群LAMP弓丨物。
发明内容
本发明的目的是根据禽白血病亚群间序列特征，提供一组用于检测B亚群禽白血 病的环介导等温扩增反应(LAMP)引物；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一组检测B亚群禽白血病病毒的环介导等温扩增反应(LAMP)引物，由一对外 引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，外引物由引物SEQ ID N0.1(F3)和SEQ ID NO. 2 (B3)组成；内引物由引物SEQ ID NO. 3 (FIP)和SEQ IDN0. 4 (BIP)组成；环引物由引物 SEQ ID NO. 5 (LF)和 SEQ ID N0. 6 (LB)组成。本发明根据禽白血病亚群间序列特征，选取禽白血病病毒gp85区段设计B亚群LAMP引物。根据所设计的B亚群LAMP引物，本发明建立了 ALV-B的分型LAMP检测方法。 本发明所建立的分型LAMP检测方法不与禽白血病其它主要亚群发生交叉反应，同时也不 与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。本发明所建立的ALV-B分型LAMP检测方法， 方便准确，现地的适用性好，准确性高、特异性强、灵敏度高。敏感性试验表明，本发明检测方 法在80分钟内能够检测出400个拷贝的病毒核 酸，比常规PCR敏感10倍。本发明建立的ALV-B的分型LAMP检测方法可以区分A、J、C、E 亚群。其结果可以通过明显的颜色变化进行判断，整个反应过程不需要开盖，极大地减少了 污染的可能性，可应用于B亚群禽白血病的分型检测，利用该技术特异、灵敏、快速及可视 化的优势，为该病的临床检测提供帮助，具有临床应用的前景。为了避免与其它亚群发生交叉反应，本发明所建立的分型LAMP检测方法将反应 温度提高为67°C，使Bst聚合酶的活性受到一定的影响；本发明方法将反应时间延长到 80min，能够检出400个拷贝的病毒核酸，比常规PCR敏感10倍。在本发明中，加入了荧光 染料FDR。该染料能够在反应液配制时加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行 结果判定。这样便极大地降低了污染的可能性，提高了该方法在现地的适用性。
图 IALV-B LAMP 与其它亚群的区分；1 :ALV_J ；2 =ALV-A ；3 =ALV-B ；4 =ALV-C ；5 ALV-E0图 2ALV-B LAMP 方法的特异性试验；1 =ALV-B ；2 =AIV ；3 =NDV ；4 =IBV ；5 =IBDV ；6 MDV ；7 =CAV ；8 =REV0图3ALV-B LAMP方法与常规PCR检测方法的敏感性比较；M :DL2000 1 :4*105质粒； 2 :4*104 质粒；3 4*103 质粒；4 :4*102 质粒；5 =^lO1 质粒；6 =H2O0
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11材料与方法1. 1 病毒J亚群禽白血病HPRS-103株、A亚群禽白血病RAV-I株、B亚群禽白血病RAV-2株、 C亚群禽白血病RAV-49株、E亚群禽白血病RAV-O株、鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株、鸡传 染性贫血病病毒(CAV)M9905株、禽网状内皮组织增生病病毒HLJR0901株由中国农业科学 院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组保存(上述毒株可从中国兽医药品监察所购买 得到)。禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡马立克氏 病病毒(MDV)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相应课题组馈赠(上述毒株也可从中国 兽医药品监察所购买得到)。1. 2ALV-B LAMP 引物的设计
对GenBank中的B亚群禽白血病病毒序列进行比对，同时比较其它亚群的相应区 域，选取gp85区段进行引物设计。利用在线软件Primer Explorer V4software (https // primerexplorer. jp)设计LAMP引物(包括一对外引物F3，B3 ；一对内引物FIP，BIP ；一对 环引物LF，LB)见表1。表1检测B亚群禽白血病病毒的LAMP引物的名称、序列和位置
权利要求
一组检测B亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus B，ALV B)的环介导等温扩增反应引物，其特征在于由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，所述外引物由引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成；所述内引物由引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成；所述环引物由引物SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6组成。
2.权利要求1所述的环介导等温扩增反应引物在制备检测B亚群禽白血病的试剂中的 用途。
全文摘要
本发明公开了检测B亚群禽白血病的环介导等温扩增反应引物，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，外引物由引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成；内引物由引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成；环引物由引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成。本发明选取禽白血病病毒gp85区段设计B亚群LAMP引物，根据所设计引物，建立了ALV-B分型LAMP检测方法，该检测方法不与禽白血病其它主要亚群发生交叉反应，同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。本发明检测方法方便准确，现地适用性好，准确性高、特异性强、灵敏度高。
文档编号C12N15/11GK101988132SQ20101052861
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者王永强, 王笑梅, 祁小乐, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龙 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所