专利名称：中华鳖微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种中华鳖微卫星DNA遗传标记。
背景技术：
微卫星DNA又称为短串连重复序列(STR)、简单重复序列(SSR)、简单序列长度多 态性(SSLP)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列；其中，最常 见的是双核苷酸重复，如((AC/TG)n及(AG/TC)n。不同的生物个体由于重复基序的重复次 数不同而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)现 象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphic information content, PIC)较高。微卫 星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为群体遗传多 样性的分析、亲缘关系的鉴定、基因组作图和遗传育种的优越的分子标记，与等位酶、RAPD 方法相比也有一定的优越性。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均勻、多态性信息丰 富、易于检测等优点被作为优良的遗传标记(genetic marker)而得到广泛应用。根据重复 单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为三种类型单一型(pure)，复合型(compound)， 间断型(interrupted)，例如单一型CACACACACACACACACACA复合型CACACACACACAGAGAGAGA间断型CACATTCACACATTCATTCA中华鳖，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳖，英文名ChineseSoftshell Turtle，拉丁文名(Pelodiscus sinensis)，中国除宁夏、新疆、青海及西藏未见报道外， 其余各省、市、自治区均有分布，以长江流域和华南地区为多见；国外分布于日本、朝鲜和越 南。中华鳖由于其药用价值和营养价值，长期被大量消耗。而且，近年来的过度捕捞、生境破 坏、化学污染等，已经导致中华鳖野生种群数量急剧下降。因此，中华鳖已被作为易危物种 列入了 1998年《中国濒危动物红皮书》和2000年IUCN(世界自然保护联盟)濒危物种红色 名录中。可见对野生种群的保护已经迫在眉睫了，但要制定切实有效的保护计划，就必须要 了解野生种群结构和遗传多样性等方面的信息。已经有学者采用不同的分子标记技术(包 括线粒体细胞色素b基因序列、12S rRNA、RAPD等)对中华鳖的遗传多样性进行研究，但是 上述遗传标记不能提供足够的遗传信息，如张永正等，中华鳖(Pelodiscus sinensis) 5个 不同地理种群细胞色素b基因序列变异及种群遗传结构分析；吴平等，亚洲淡水和陆生龟 鳖类12S rRNA基因片段的序列分析和系统发生研究；肖亚梅等，中华鳖种群RAPD分析。为 了进一步了解中华鳖野生种群结构和遗传多样性等方面的信息，需要开发新的分子遗传标 记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于分离克隆中华鳖微卫星DNA标记，建立中华鳖 微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行中华鳖的分类，亲权鉴定及遗传多样性的分析。本发明解决技术问题的技术方案中华鳖微卫星DNA标记，包括中华鳖微卫星 (CA)n, (AAC)n, (ACAG)1^P (GATA)n富集文库的构建，含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测 序，得到63个含有微卫星重复序列的克隆，确定了 22个多态性丰富的微卫星标记PSW01、 PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSfflU PSW12、PSW13、 PSW14.PSW15 ；PSffOl为472个核苷酸、PSW02为375个核苷酸、PSW03为368个核苷酸、PSW04 为416个核苷酸、PSW05为346个核苷酸、PSW06为423个核苷酸、PSW07为337个核苷酸、 PSW08为379个核苷酸、PSW09为291个核苷酸、PSWlO为336个核苷酸、PSWll为345个核 苷酸、PSW12为367个核苷酸、PSW13为356个核苷酸、PSW14为371个核苷酸、PSW15为396 个核苷酸。
图1 :PSW01位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型2 :PSW02位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型3 :PSW03位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型4 :PSW04位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型5 :PSW05位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型6 :PSW06位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型7 :PSW07位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型8 :PSW08位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型9 :PSW09位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型10 =PSfflO位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型11 =PSffll位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型12 :PSW12位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型13 :PSW13位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型14 :PSW14位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型15 :PSW15位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型图在图1-图15中，1-22分别代表1-22只中华鳖。
具体实施例方式下面结合附图进一步详述本发明。1、中华鳖微卫星DNA富集文库的构建1. 1 基因组的提取与酶切参照 Sambrook 等(2002，Molecular Cloning, 3nd463-471)的方法提取中华鳖基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AI (购自TaKaRa公司) 酶切基因组，酶切产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下400-1000bp大小的DNA片段 并用胶回收试剂盒(购自上海生工)纯化回收的酶切产物。1. 2 加接头将纯化回收的酶切产物的两端加入接头SauL-F (5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)
SauL-R(5，-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC_3，)，在T4连接酶(购自Promega公司)作用下16°C水浴连接过夜。1.3PCR检测接头连接以SauL-F为引物，以1. 2工序制的连接产物为模板进行PCR，50 μ L反应体系如 下5yL IOXexTaq 缓冲液，4 μ L MgCl2,4y L dNTP,0. 25 μ L exTaq 酶(购自 TaKaRa 公 司)，2yL引物SauL-F，5yL连接产物，加双蒸水(ddH20)补至50 μ L。PCR反应程序如下 95°C预变性5分钟，94°C变性45秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分钟，变性至退火三个步 骤重复35次，72°C充分延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯 化。1. 4磁珠富集将1. 3所制的纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针杂交探针(CA) 12、(AAC)8, (ACAG) 6和(GATA) 6分别在72°C、58°C、67°C、55°C下杂交7小时。将杂交液加入已平衡好的 磁珠，室温放置30分钟。将离心管依次用洗涤缓冲液(6XSSC，0. 1% SDS ；2XSSC,0. 1% SDS ； IX SSC, 0. 1% SDS)于45°C洗两次，再用双蒸水室温洗一次。最后加双蒸水，在PCR仪 上95°C变性15分钟，收集上清。1. 5PCR 富集以磁珠富集产物为模板，SauL-F为引物进行PCR扩增，50 μ L反应体系如下富集后的 DNA30y L，5y L IOXexTaq 缓冲液，4 μ L MgCl2,4y L dNTP,0. 25 μ L exTaq聚合酶，2 μ L弓丨物SauL-F,加双蒸水补至50 μ L。PCR反应程序如下95°C预变性5分 钟，94°C变性40秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分钟，变性至退火三个步骤重复35次，72°C 充分延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。1. 6感受态细胞的制备将ImL过夜培养的E. coliDH5 α培养液接于50mL液体LB培养基中，37°C振荡培 养2小时至对数生长期(0D·达到0. 3-0. 5)时取出。将菌液于4°C离心10分钟。弃上清， 加入ImL 0. lmol/L预冷的CaCl2重新悬浮细胞，用枪头轻轻打勻。4°C离心10分钟。弃上 清，加入预冷的甘油/CaCl2混合物重新悬浮菌体，用枪头打勻，-80°C保存。1. 7 倒平板将LB固体培养基完全融化，冷却至50°C左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养 基(比例为LB固体培养基IOOmL ；氨苄青霉素(Amp) 100 μ L ；20%异丙基-β -D-硫代半乳 糖苷(IPTG) 7 μ L ;2 % 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal) 40 μ L)，混合均勻后 倒入一只培养皿里，待培养基凝固后放入37°C烘箱，晾干水蒸气。1. 8连接转化取1. 5工序所制的PCR富集后的纯化产物加入PMD18-T载体(购自TaKaRa公司) 于16°C水浴连接2小时后，放于4°C冰箱过夜，制成连接产物。取出1.6工序制成的感受态细胞，冰上复苏至液态，加入上述连接产物，混勻。冰 浴30分钟后放入42°C水浴锅，热激90秒，立即放入冰中冰浴2分钟，加入新鲜的LB培养 基，37°C振荡培养1小时。取100 μ L培养液涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG培养基上，37°C倒 置培养过夜。2、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计
2. 1 菌落 PCR 将平板上的白色单菌落分别放入事先装有LB/Amp培养基的EP管中。37°C振荡培 养至菌液浑浊。12. 5yL PCR反应体系包括Taq酶0. 25U(购自TaKaRa公司)，IOXBuffer 1. 25 μ L, dNTP 0. 2 μ M，MgCl22 μ M，引物 0· 4 μ M(SauL_F，primer- (CA) 12、(AAC)8, (ACAG)f^P (GATA) 6)，菌液0· 5 μ L，加双蒸水补足体积。反应程序95°C预变性5分钟，94°C变性40秒， 60°C退火45秒，72°C延伸1分钟，变性至退火三个步骤重复35次，72°C充分延伸10分钟， 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。2. 2阳性克隆测序及引物设计阳性克隆送生物公司测序，共得到63条含有微卫星DNA的序列。根据微卫星DNA 侧翼序列，利用软件primerprimer5设计63对微卫星引物。并对这63对引物进行PCR扩 增检测，最终有33对引物能稳定扩增出目的条带。对这33对引物的上游引物5’端分别用 FAM, HEX, TAMRA进行荧光标记。3、中华鳖多态性微卫星位点引物的筛选及结果分析3. 1筛选有多态性的引物用1. 1工序中Sambrook等提取基因组的方法提取22只中华鳖基因组。用2. 2工 序设计所得的33对引物扩增基因组。反应程序95°C预变性5分钟，94°C变性40秒，60°C 退火45秒，72°C延伸1分钟，变性至退火三个步骤重复35次，72°C充分延伸10分钟，1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经ARI PRISM 3730遗传分析仪(Applied Biosystem公司) 进行基因分型(Genotyping)，使用Genemarkerl. 6软件(Applied Biosystem公司)判读等 位基因片段的具体数值。共得到15个具有多态性的微卫星标记(见表1) :PSW01、PSW02、 PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSfflU PSW12、PSW13、PSW14、 PSW15 ；PSffOl为472个核苷酸、PSW02为375个核苷酸、PSW03为368个核苷酸、PSW04为416 个核苷酸、PSW05为346个核苷酸、PSW06为423个核苷酸、PSW07为337个核苷酸、PSW08 为379个核苷酸、PSW09为291个核苷酸、PSfflO为336个核苷酸、PSffll为345个核苷酸、 PSW12为367个核苷酸、PSW13为356个核苷酸、PSW14为371个核苷酸、PSW15为396个核 苷酸。3. 2结果分析使用CervuS3. O软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用Gen印op4. O软件计算 哈代一温伯格以及连锁不平衡的值，以此来描述15个中华鳖微卫星DNA多态位点的特征。由附图1-15可看出，本发明的15个微卫星序列的长度在供试的22只中华鳖中都 出现的多样性，由此可见，本发明的这15个微卫星标记能用于研究中华鳖的品种分类和遗 传关系分析。本发明提供了 15个中华鳖的新的微卫星位点及扩增这15个微卫星位点的引物序 列和扩增方法，可应用于中华鳖不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重 复性好，是一种可靠有效的分子标记。表1引物特性表位点，重复基序，引物序列，退火温度位点
重复基序
引物序列(5’-3’)
PSffOl PSW02 PSW03 PSW04 PSW05 PSW06 PSW07 PSW08 PSW09 PSfflO PSffll PSff 12 PSff 13 PSW14 PSff 15
(GATA)
21
(CAAAA)6 (CAA)f
(GATA)12
(GATA)17
(ATAG)21
(AAC)10
(GATA)
22
(GATA)25
(GT)19
(TAGA)17
(GATA)25
(CA)17
(AGAC)7
(TAGA)
16
(GAAA)i序列表<110>安徽师范大学<120>中华鳖微卫星DNA标记<130>1<160>15
F TGTTGTTTTGTATGATGAGAA
RATTTGCTGTAATAGTGGCT F TGCCAATATAGTCTCAGTAGT R GAAGGAAGTTGTTAGAACATC
FGCTAAGTTTTCCTATTTTTC
RGTTGTATGGTCCTTGTTCT
FATCACCTGACCATCTGTTTC
RTTCTCTCTGCCATCTTACTT
FCCTTGAACGCACTCTGTCTA
RTTTTGCTCATAGTGTTTCCC
FTTAGAGGTAGTGGAAGACAG
RTTAGTTAGCCAATAAGGATA
FTTACTGTCAAGTGCTGTCCC
RAGCGAATCCATAATCCTGTT
FTGTCACCACACTACCTATTT
RGTGTTCTTAGTCCACTCCTC
FCGAAGGTGAAAAAAGGTGTT
RATGTTTGTTTGCTGGGAAGG
FTAGACCAGGACCCCCTTATT
RTGATGGGATGTGGTAGCAGT
FGAGGTTGTCTTATTCTCTGC
RTCACAAGCCTTACTAAAAAC
FCAAAGGATACCATCACCAAG
RGAATAAGGGAAGTCAGAGGC
FATTTTTTTGGCATCCTTGTA
RCTCTTTCCGTCTGTCTTTTT
FTAGTCCTTTATTGAACCCTG
RCTTGAAAGAGCATCTCCATA
FTAAAGTGAGGCTAGAGAAG
RAAAAAATGAGTGAGTGATG
火度 退温
C)
58
60
58
60
58
55
56
58
58
60
60
58
58
58
58
100066]<170>PatentIn Version3. 30067]<210>10068]<211>4720069]<212>DNA0070]<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensi0071]<400>10072]ctctctcacccacatattcccccatccatc0073]gaatagaacagattaaaaggagaggattaa0074]acgggtgatactttgaaatcatcacaaaca0075]tagatagatagatagatagatagatagata0076]tagatagatagatagatagatagataggta0077]ctgtataaaagacaggtattatataaaaga0078]atttgcaggaaacaagtataggatgttaaa0079]gcttaaatcacactgaagtgatcaggattt0080]<210>20081]<211>3750082]<212>DNA0083]<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensi0084]<400>20085]tgccaatatagtctcagtagtatagacttg0086]tcttctcctagaagcactgtgtgcaaaatt0087]tgtcaaaacaSLSLSLCSLSLSLSLCSL3.3.3. C 3.3.3.3. C 3.0088]gtttttccctaagtgagatgttctaacaac0089]ttgctacctccactagtattagctgttttt0090]accaagaaaagtgtattgctctgatagcac0091]tccaatgtcctcaca0092]<210>30093]<211>3680094]<212>DNA0095]<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensi0096]<400>30097]gctataatgtttgctaagttttcctatttt0098]aatgaaaattacaattgctttgaactggcc0099]cttgtatgcattaatattgacatataattg0100]tctttcgatagatagatagatagatagata0101]tgcatctgtctgtctgtccctgagtccatc0102]gtttaagaactcctcctaaactgtaagaac0103]cctaactt0104]<210>4
S)
caagaaacatgctgttgttttgtatgatga60ctttcaaggagggtttagctagctatactt120tttacgtcaatcacatgttccatttaacga180gatagatagatagataggtagatagataga240gatagccactattacagcaaatttaaaatg300caggtattatcccagatttatagacacatg360atcccaattcagcaaaacacttaagcacat420aagtgctttgctgaactgttta472S)ccctaaaagattaaaatggcagatatgagg60gtacactttcatatgcgctatgtttgtcaa1203.3.3. C 3.3. C 3.3. C3.3. C 3.3. C 3.3. C 3.aaaacctgct180ttccttctaggacaaggtggaaagtagcaa240ggtccaattcattacactttgttcccaaac300ttactgtagaagagttttcagaagagagaa360375S)tccatgtattttgcagttagtaagtgtttt60attctccttggggccgtaccggacgtttca120ctagacatagaattgcaagatatctacaca180gatagatagatagatagatagatagatttg240tattccatctgtctgtctgggagtccattt300aaggaccatacaactcgaaatttctcttgt360
368
11
<211>416<212>DNA<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)<400>4tgagccaatttccagatcgccttgactgattttcaaatcacctgaccatctgtttcaaat60
ttaagcatcccaaagtgcacaaagtctaaatagataaggcaagtcttaaattatgtacag120
agtgatactttaaatgatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatag180
atagatagatagatagatagatagaattccatccgcagggctatcgttaactttaaggca240
tataactgtatttgtatctgagagaaaaaatcattgttgagataatatatctgaagataa300
ctcacaaatgaatgcacaaagtaagatggcagagagaaagtccaaggggactcactaata360
atacttcacacagaattgttaagattgtcattctgagatattccagctag3.3. 3. 416
<210>5
<211>346
<212>DNA
<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensiS)
<400>5
aatgatgcaaagagacaaattaagtgtttgatgcatattttattccccttgaacgcactc60
tgtctaaaaataatagtgctattatttttggacagccactggcttagtggccaactgttt120
gattgctagaatgcaagttcttaagtatagatagatagatagatagatagatagatagat180
agatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagagttatgtga240
ttaaatgccattaccattatgcattccctgtttttgtgtaatgcctgcataagattttta300
gatggcataaagggaaacactatgagcaaaatgttcctgtttgatc346
<210>6
<211>423
<212>DNA
<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensiS)
<400>6
ggttggccactttaagtgaagcaggttcagctcgctgatgttagaggcaaatgtcccccc60
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gcttcaggcagggaatgaacatccgtagtggttaccccgggatgggggta3.3.3.3. C 3.3. C 3.3.240
CSLSLCSLSLCSLSLCSLSLCSLSLCSLSLCSL3. C 3.3.3.3. C 3.3. Cctaggaagctgcttgaaaccctttggaatg300
aagttaaatcctgggagaagagatatggcatgtgaaagactctcgttttcctggaatgga360
agatatccttattggctaactaatatatgaaggccttgcacccacctgct420
CCC423<210>7<211>337<212>DNA<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensis)
<400>7
cttctcccccgaatcttttccaagccccacacatatcttctttattactgtcaagtgctg60
tccccctcttttgattcccaacaatagatttggactatccaagcttccgacaagaaggtg120
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atttgttttattagtctcactgcgtcactgctactac337
<210>8
<211>379
<212>DNA
<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensiS)
<400>8
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<210>9
<211>291
<212>DNA
<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensiS)
<400>9
ctagaaatctagctctgctatgatgttggtcgaaggtgaaaaaaggtgttaaaatgcagt60
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tcatgtttcctaagctgtggagcatacgaatgaaagcttaattgtttgtct291
<210>10
<211>336
<212>DNA
<213> 中华鳖(Pelodiscus sinensiS)
<400>10
attattaccgtggtacctaggagccctcgttatagaccaggacccccttatttagatacc60
tccgccttttaatggatttcctgccctaggaatctgccattttagatagatagatagata120
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ttcactctgtgaggtaactaattcctgctatggaagaaccttccctcccaatacccaaat240
ctgagactgctaccacatcccatcagggtaactccagtgggacacaccagctcttctgtt300
<400>14
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tttactataactgttaatgacttatatgga gatgctctttcaagtagaattgagtttcaa360
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<210>15
<211>396
<212>DNA
〈213〉中华鳖(Pelodiscus sinensis)
<400>15
gctaccacttagaacatgctgccccaggaa acctaaagtaattaaagtgaggctagagaa60
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ccccccaaagacctaatttctgtatttgca aatgggataccatcactcactcatttttta360
gggataccatgctttagctcattcagcttt tggggt39权利要求
中华鳖微卫星DNA标记，其特征在于所述的微卫星标记编号分别为PSW01、PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15；其核苷酸序列为PSW01ctctctcacc cacatattcc cccatccatc caagaaacat gctgttgttt tgtatgatga60gaatagaaca gattaaaagg agaggattaa ctttcaagga gggtttagct agctatactt120acgggtgata ctttgaaatc atcacaaaca tttacgtcaa tcacatgttc catttaacga180tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagataggta gatagataga240tagatagata gatagataga tagataggta gatagccact attacagcaa atttaaaatg300ctgtataaaa gacaggtatt atataaaaga caggtattat cccagattta tagacacatg360atttgcagga aacaagtata ggatgttaaa atcccaattc agcaaaacac ttaagcacat420gcttaaatca cactgaagtg atcaggattt aagtgctttg ctgaactgtt ta472PSW02tgccaatata gtctcagtag tatagacttg ccctaaaaga ttaaaatggc agatatgagg60tcttctccta gaagcactgt gtgcaaaatt gtacactttc atatgcgcta tgtttgtcaa120tgtcaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaacaac aacaacaaca aaaacctgct180gtttttccct aagtgagatg ttctaacaac ttccttctag gacaaggtgg aaagtagcaa240ttgctacctc cactagtatt agctgttttt ggtccaattc attacacttt 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2.根据权利要求1所述的中华鳖微卫星标记，其特征在于所述的PSW01、PSW02、 PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15 十五个位点的引物序列为PSffOlFTGTTGTTTTGTATGATGAGAAPSffOlR:ATTTGCTGTAATAGTGGCTPSW02FTGCCAATATAGTCTCAGTAGTPSW02RGAAGGAAGTTGTTAGAACATCPSW03F:GCTAAGTTTTCCTATTTTTCPSW03R:GTTGTATGGTCCTTGTTCTPSW04F:ATCACCTGACCATCTGTTTCPSW04RTTCTCTCTGCCATCTTACTTPSW05FCCTTGAACGCACTCTGTCTAPSW05RTTTTGCTCATAGTGTTTCCCPSW06FTTAGAGGTAGTGGAAGACAGPSW06RTTAGTTAGCCAATAAGGATAPSW07FTTACTGTCAAGTGCTGTCCCPSW07R:AGCGAATCCATAATCCTGTTPSW08FTGTCACCACACTACCTATTTPSW08R:GTGTTCTTAGTCCACTCCTCPSW09FCGAAGGTGAAAAAAGGTGTTPSW09R:ATGTTTGTTTGCTGGGAAGGPSfflOFTAGACCAGGACCCCCTTATTPSfflORTGATGGGATGTGGTAGCAGTPSffllF:GAGGTTGTCTTATTCTCTGCPSffllRTCACAAGCCTTACTAAAAACPSW12FCAAAGGATACCATCACCAAGPSW12R:GAATAAGGGAAGTCAGAGGCPSW13F:ATTTTTTTGGCATCCTTGTAPSW13R:CTCTTTCCGTCTGTCTTTTTPSW14FTAGTCCTTTATTGAACCCTGPSW14RCTTGAAAGAGCATCTCCATAPSW15FTAAAGTGAGGCTAGAGAAGPSW15RAAAAAATGAGTGAGTGATG。
全文摘要
本发明公开了中华鳖微卫星DNA标记，包括中华鳖微卫星(CA)n、(AAC)n、(ACAG)n和(GATA)n富集文库的构建，微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到63个含有微卫星重复序列的克隆，确定了15个多态性丰富的微卫星标记PSW01、PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15；本发明可应用于中华鳖不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK101984055SQ201010528420
公开日2011年3月9日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者刘罗, 卜兴江, 聂刘旺 申请人:安徽师范大学