专利名称：检测a亚群禽白血病病毒的环介导等温扩增反应引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测动物疾病的引物，尤其涉及用于检测A亚群禽白血病病毒的 环介导等温扩增反应(LAMP)的特异性引物，属于A亚群禽白血病的检测领域。
背景技术：
禽白血病是由禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV)引起的以多种肿瘤发 生为特点的免疫抑制性疾病。目前，由于我国对禽白血病的净化缺乏有效的措施和完善的体系，由禽白血病病 毒感染或禽白血病病毒与其它禽免疫抑制病病毒混合感染造成的疾病暴发或免疫抑制时 有发生，近两年来，该病的感染情况越发严重，给养禽业造成了巨大的经济损失。根据病毒中和试验、病毒干扰试验及囊膜蛋白基因序列，可将ALV分为多个亚群。 其中，鸡ALV包括外源性的A、B、C、D、J亚群和内源性的E亚群。经典ALV-A以淋巴细胞 瘤为主，还有多种其他类型的细胞瘤，包括血管瘤。A亚群曾被认为是商业产蛋鸡群中(尤 其是来航鸡)最普遍的外源性病毒亚群。近年来也有A亚群感染的报道，乔彦华等从2006 年采集自北京的鸡场病料中分离到一株A亚群禽白血病；何爱飞等报道了 2008年在贵阳 市乌当区某商品蛋鸡群发生了 A亚群禽白血病病毒引起的血管瘤型禽白血病。Zhang等在 进口的肉用种鸡中分离到一株A亚群病毒。此外，有报道A亚群与其它亚群共感染的现象。 Fenton等发现A、J亚群能够感染同一只鸡。Spencer等从商品蛋鸡群中同时检测到ALV-A 和ALV-B，这种共感染为病毒亚群间重组提供了可能。Lupiani等分离到三株J/A重组病 毒。近年来，马立克疫苗被A亚群禽白血病污染的事件时有报道。这再一次引起了研究人 员对A亚群的关注，因此对A亚群的分型检测就显得十分必要。LAMP技术以其特有的优势， 自2000年被发明以来，受到了各研究领域的极大关注。LAMP技术是一种依赖Bst聚合酶特性以成环扩增为核心的核酸扩增技术。该技术 由于需要4(或6)条引物，对6(或8)个特定的区域进行识别，因而特异性强。对LAMP技 术来说，引物设计是其核心。同时，对于禽白血病病毒的分型检测来说，实现分型的关键也 在于引物。
发明内容
本发明的目的是提供一组用于禽白血病病毒的分型检测的LAMP引物；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明通过对禽白血病病毒各亚群基因组的比对，选取禽白血病病毒gp85区段 作为LAMP引物设计区域，筛选出一组扩增效率良好的引物，其中，所述引物由一对外引物、 一对内引物和一对环引物所组成，其中，外引物由SEQ ID NO. 1 (F3)和SEQ ID NO. 2 (B3)组 成；内引物由 SEQ ID NO. 3 (FIP)和 SEQ ID NO. 4 (BIP)组成；环引物由 SEQ ID N0. 5 (LF)和 SEQ ID N0. 6 (LB)组成。在本发明所设计的LAMP引物的基础上，本发明成功建立了 A亚群禽白血病病毒的分型LAMP检测方法，由于设计了一对环引物，极大的加速了反应的进程，缩短了反应所 需的时间，能够在45min内检出20个拷贝的病毒核酸，比常规PCR敏感100倍(Blomstrom etal. ,2008 ；Endo et al. ,2004 ；Mao et al. ,2008 ；Nagamine et al. ,2001 ；Yoneyama et al.，2007 ；Zhang et al.，2009)。本发明所建立的A亚群禽白血病的LAMP检测方法能够成功地将A亚群病毒与J亚 群、B亚群、C亚群、E亚群病毒相区分，同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反 应。敏感性试验表明该方法能够在45分钟内检测出20个拷贝的病毒核酸，比常规PCR敏 感100倍。实现了对A亚群的快速检测，而且其结果可通过颜色变化进行判定。整个反应 过程不需要开盖，极大地减少了污染的可能性，具有现地应用的前景。 总之，本发明所建立的ALV-A LAMP检测方法准确性高、灵敏度高、特异性强。在本发明检测方法中加入了荧光染料FDR。该染料能够在反应液配制时加入，反应 结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定。这样便极大地降低了污染的可能性。 这在引物筛选时，显得极为重要，因为不论结果判定是通过凝胶电泳，还是反应结束后加入 SYBR Green I类染料，开盖容易使大量的LAMP产物形成气溶胶，污染整个实验环境，加之 LAMP反应极高的敏感性，极易造成污染，甚至无法再进行LAMP试验的严重后果。这也是很 多研究人员发现LAMP容易产生假阳性的主要原因之一。而且这种直接通过颜色变化进行 结果判定的方式更适合现地的应用。通过对临床样品的检测，发现LAMP的阳性率更高，这 一方面是由于LAMP比PCR具有更高的敏感性；另一方面是由于Bst聚合酶具有更强的赖受 性，实现扩增的能力更强，对于模板的纯度要求没有常规PCR所用的聚合酶高。
图 IALV-A LAMP 与其它亚群的区分；1 :ALV_J ；2 =ALV-A ；3 =ALV-B ；4 =ALV-C ；5 ALV-E0图 2ALV-A LAMP 方法的特异性；1 =ALV-A ；2 =AIV ；3 =NDV ；4 JBV ；5 JBDV ；6 =MDV ； 7 =CAV ；8 =REV0图3ALV-A LAMP方法与常规PCR检测方法的敏感性比较；M :DL20001 :2*104质粒； 2 :2氺IO3 质粒；3 :2氺IO2 质粒；4 ^^IO1 质粒；5 :2*10° 质粒；6 =H2O0
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1一、材料方法1材料与方法1. 1 病毒J亚群禽白血病HPRS-103株(GenBank登录号Z46390)、A亚群禽白血病RAV-1株 (GenBank登录号M19113)、B亚群禽白血病RAV-2株(GenBank登录号M14902)、C亚群禽白血病RAV-49株(GenBank登录号V01197)、E亚群禽白血病RAV-O株(GenBank登录号 M12172)、鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株(GenBank登录号AY444873)、鸡传染性贫血病病 毒(CAV)M9905株、禽网状内皮组织增生病病毒HLJR0901株由中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所禽免疫抑制病课题组保存(也可从中国兽医药品监察所购买得到)。禽流感病毒 (AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)由中国 农业科学院哈尔滨兽医研究所相应课题组馈赠(上述毒株也可从中国兽医药品监察所购 买得到)。1. 2ALV-A LAMP 引物的设计对GenBank中的A亚群禽白血病病毒序列进行比对，同时比较其它亚群的相应区 域，选取gp85区段进行引物设计。利用在线软件Primer Explorer V4 software (https // primerexplorer. jp)设计LAMP引物(包括一对外引物F3，B3 ；一对内引物FIP，BIP ；一对 环引物LF，LB)见表1。表1检测A亚群禽白血病病毒引物的名称、序列和位置
权利要求
一组用于检测A亚群禽白血病病毒(avian leukosisvirus A，ALV A)的环介导等温扩增反应引物，其特征在于所述引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物所组成，其中，所述外引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成；所述内引物由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成；所述环引物由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成。
2.权利要求1所述的环介导等温扩增反应引物在制备检测A亚群禽白血病病毒的试剂 中的用途。
全文摘要
本发明公开了检测A亚群禽白血病病毒(ALV-A)的环介导等温扩增反应引物，所述引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物所组成，其中，所述外引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成；所述内引物由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成；所述环引物由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成。在所设计LAMP引物的基础上，本发明成功建立了A亚群禽白血病病毒的分型LAMP检测方法，该方法能够成功将A亚群病毒与J亚群、B亚群、C亚群、E亚群病毒相区分，而且不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。本发明所建立ALV-A LAMP检测方法准确性高、灵敏度高、特异性强。
文档编号C12Q1/68GK101988131SQ201010528610
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者王永强, 王笑梅, 祁小乐, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龙 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所