使体细胞重编程以形成诱导全能干细胞的组合物,和用其形成诱导全能干细胞的方法

专利名称：使体细胞重编程以形成诱导全能干细胞的组合物,和用其形成诱导全能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及使体细胞重编程以形成诱导全能干细胞的组合物，以及使用所述组合 物形成诱导全能干细胞的方法，所述组合物包含0ct4以及anil或其上游调节子。更具体 而言，本发明涉及以下技术，其中当导入Octl和选自Sih(Sonic hedgehog)、氧留醇和嘌吗 啡胺(purmorphamine)的重编程因子时，它们协同作用以诱导体细胞进行重编程过程从而 形成诱导全能干细胞。
背景技术：
干细胞的特征在于自我更新，即经过多个细胞分裂循环依然保持未分化状态的能 力，和潜能，即在合适的条件下分化为特定细胞类型的能力。潜能特指干细胞的分化潜能 性，并通常分为全潜能(pluripotency)、多潜能(multipotency)和单潜能。因此，使干细胞 在细胞培养物中进行自我更新并将它们转化为特定细胞的技术在各种疾病的细胞疗法中 具有较高的潜在功用。存在于成人体中，包括造血干细胞、骨髓干细胞和神经干细胞在内的各种干细胞 可用于医疗而不会诱发免疫排斥反应，这是因为它们可以由患者自身进行分离。此外，使用 成体干细胞的细胞疗法解决了保证器官移植供体的难题。迄今为止，已知成体干细胞保留了多潜能性，S卩，能分化为多种细胞，但仅仅是 密切相关的细胞家族中的那些细胞。许多报道提到了以下效果，即分离自中枢神经系 统(Science 255，1707-1710 1992 ；Science 沘7，1433-14382000)、骨髓(Science 276， 71-74,1997 ；Science 287,1442-1446,2000 ；Science 284，143-147，1999)、视网膜 (Science 287，2032-2036，2000)和骨骼肌(Proc. Natl. Acad. ki. USA 96,14482-14486, 1999 ；Nature 401，390-394，1999)的干细胞转化为密切相关的组织细胞。例如，造血干细 胞能分化为血液相关细胞，神经干细胞能分化为神经元或神经胶质细胞，以及骨髓干细胞 能分化为中胚层细胞。此外，尽管理论上它们进行无限的自我更新，但成体干细胞实践中难 以在体外增殖。而且，由患者分离大量细胞在实践中受到限制。全能干细胞是克服成体干细胞缺点的理想资源。全能干细胞能分化为几乎任何细 胞并且能在体外无限复制。迄今已知的全能干细胞有胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和胚胎癌 细胞，大多数研究集中于胚胎干细胞用于分化为特定细胞、在疾病动物模型中的功能性以 及针对各种疾病的治疗潜在功效。尽管如此，与成体干细胞相似，胚胎干细胞的临床使用也遇到必须逾越的障碍。首 先，由于分离胚胎干细胞将导致受精人胚胎的死亡，这引发了伦理问题。而且，当将源自胚 胎干细胞的已分化细胞植入患者时会有免疫排斥问题。已进行各种尝试以克服上述问题。最多的注意力尤其关注于将已分化的细胞重编 程为分化之前的细胞。重编程是通用术语，表示通常通过核转移、细胞融合、细胞提取物处 理和诱导全能干(iPS)细胞技术(Cell 132，567-582，2008)实现的诱导已分化的细胞去分化为全能干细胞，诸如胚胎干细胞。与任何其他技术相比，所述iPS细胞技术成功地形成更接近于胚胎干细胞的细 胞。自2006年首次产生iPS细胞以来，已经发表了大量研究文章。原则上，通过将四种基 因(重编程诱导基因0ct4、Sox2、Klf4 和 C-Myc/0ct4、Sox2、Nanog 和 Lin28)转染到小 鼠或人的体细胞中，随后在胚胎干细胞专用条件下长时间培养，就可得到与胚胎干细胞相 似的干细胞，例如iPS细胞。这些iPS细胞已显示出在其基因表达方式、表观遗传状况、体 外和体内分化为所有三种胚层、畸胎瘤形成、嵌合小鼠生成和嵌合体的种系传递能力(Cell 126,663-676,2006 ；Science 318，1917-1920，2007)等方面与胚胎干(ES)细胞相类似。然而，对重编程的分子机理还缺乏理解，这主要是由于使用过多遗传因子。为了在 实践临床应用中发挥iPS细胞的完全效能，必要的是改善所述已建立起来的重编程技术， 并且对每种产生的iPS细胞系的安全和功效进行评估。最近的研究报道指出肿瘤抑制基因P53的失活显著地提高iPS细胞产生的效率 (Nature 460，1132-1135,2009)。pl9Arf 禾口Arf/InMa 基因座的替代性阅读框 进行编码，已知分别诱导P53和Rb的表达。相对于只降低pl9Arf表达所能获得iPS细胞形 成，通过同时减少pl6Ink4a和pl9Arf的表达能提高iPS细胞形成(Nature, 460,1140-1144， 2009)。多梳组(Polycomb group) (PcG)蛋白是表观遗传学基因沉默子。toil是PcG蛋白 之一，参与pl6Ink4a和pl9Arf的下调，导致对P53和Rb表达的抑制(Genes Dev, 2678-2690, 1999)。此外，已知aiii 1通过重塑染色质组织而调节目标基因的表达。这些功能使得ani 1在 神经干细胞和造血干细胞的自我更新中起到重要作用。基于此，本发明人通过在细胞中过 表达anil而成功地对星形胶质细胞进行重编程，从而诱导出神经干细胞。所诱导的神经干 细胞在许多方面与由小鼠分离的那些神经干细胞相类似。尤其是，发现所诱导的神经干细 胞具有提高的Sox2表达水平，Sox2是神经干细胞自我更新必需的基因(Biochem Biophys Res Commun. 371，267-272，2008)。为了去分化，体细胞需要四种(0ct4、Sox2、Klf4、C-Myc)或三种(0ct4、Sox2、 Klf4)基因。已知对于内源性表达这些基因的细胞，可以不再向其中导入这些基因。典型 地，已证实单独导入0ct4可诱导由小鼠/人神经细胞生成iPS细胞，这是由于小鼠/人神 经细胞显示出Sox2、Klf4和C-Myc的内源性表达(Nature，461，649-653，2009)。然而，在 本领域中已知还没有单独用0ct4因子产生全能胚胎干细胞样细胞的方法。

发明内容
本发明人设想，通过Oct的过表达结合可导致Sox2诱导和Pie1nk4a和pl9Arf下调的 Bmil过表达，能建立诱导全能干细胞。在此设想的基础上，将所述两种基因导入体细胞中， 然后在用于培养胚胎干细胞的条件中培养。结果，建立了类似胚胎干细胞的细胞系。已发 现所建立的细胞系与胚胎干细胞之间的各种性质均高度相似，包括基因表达、表观遗传学、 体外/体内分化为所有三种胚层、畸胎瘤形成和嵌合小鼠生成。此外，本发明人想到采用anil的上游调节子可能减少重编程通常所需的基因数 目。观察到aih (Sonic hedgehog) (Bmil的上游调节子)及其类似物提供了与所述toil基 因过表达系统中相同的结果。
因此，本发明的目的是提供用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞 的组合物，所述组合物包含0ct4基因以及anil或其上游调节子，例如Shh或其类似物。本发明的另一个目的是提供通过导入0ct4基因以及aiiil、Shh或Shh类似物将体 细胞重编程以产生胚胎干细胞样细胞的方法。本发明的再一个目标是提供通过所述方法产生的胚胎干细胞样细胞。


由以下结合附图的详细描述，能更清楚地理解本发明的上述以及其他目的、特征 和其它优点，所述附图中图Ia至图Ic显示了将两种因子0ct4和Sox2基因(2F)，和将三种因子0ct4、Sox2 和toil基因QF-Bmil)导入小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率。图Ia显示了由AP (碱性磷酸酶)染色测定的导入两种因子(0ct4和Sox2基因) 和导入三种因子(Bmil、0ct4*Sox2)的iPS细胞产生频率。由感染2F_Bmil QF-Bmil-Ips) 的细胞产生AP-阳性集落，而感染2F的细胞未产生AP-阳性集落(左)J^AP-阳性集落进 行计数(右)。图Ib显示了建立的2F-Bmil_iPS细胞的形态学，其与ES细胞的相似。图Ic显示了由免疫化学染色所检测的在mES细胞(上图)和2F-Bmil_iPS细胞 (下图)中胚胎干细胞特异的SSEAl、0ct4、Sox2和Nanog的表达。在二者中也检测了 AP-阳
性集落。图加至图2d显示了通过toil逆转录病毒转导将小鼠胚胎成纤维细胞去分化为 神经干细胞。图加显示了在小鼠胚胎成纤维细胞中anil的表达、Sox2表达水平的提高和toil 标靶基因Pie1nk4a和pl9Arf表达水平的降低。图2b显示了当在用于神经干细胞的条件中培养时，Bmil诱导的小鼠胚胎成纤维 细胞于第3天开始聚集并于第7天改变其形态为神经球形态。图2c显示了由AP染色和针对Nestin和Sox2，神经干细胞特异性标记物的免疫细 胞化学对神经干细胞样细胞进行的表征。图2d显示了 toil诱导小鼠胚胎干细胞得到的神经干细胞样细胞分化为神经元、 少突胶质细胞和星形胶质细胞的多潜能，该图通过针对它们各自的代表性标记物Tujl、04 和GFAP的免疫细胞化学而测定。图3a至图3f显示了通过0ct4和toil逆转录病毒转导将小鼠胚胎成纤维细胞去 分化为神经干细胞。图3a显示了 mES细胞和通过将toil和0ct4基因导入小鼠胚胎成纤维细胞而建 立的BO-iPS的ESC-样形态。针对toil和0ct4的组合和单独的0ct4给出了重编程效率 (右图)。与toil组合的0ct4诱导mES进行重编程过程，成功地形成约50个集落，然而 0ct4单独则不行。图北显示了由RT-PCR所测量的诱导干细胞中的重要基因的表达模式与mES细胞 相似。 图3c显示了由实时PCR所测量的参与胚胎干细胞自我更新的重要基因的表达模式在诱导干细胞和胚胎干细胞之间相似。图3d显示了由免疫细胞化学所测量的在所述诱导干细胞中胚胎干细胞特异性标 记物的表达。图!Be显示了由蛋白印迹分析测量的诱导干细胞和胚胎干细胞中0ct4和Sox2的 表达。图3f显示了由FACS分析测量的在诱导干细胞中SSEAl和0ct4的表达达到与胚 胎干细胞相似的程度，但与小鼠胚胎成纤维细胞不同。图如至图4b显示了本发明的胚胎干细胞样细胞的表观遗传学改变。图如显示了由亚硫酸氢盐测序而测定的参与胚胎干细胞的自我更新的0ct4和 Nanog的启动子区域的甲基化。在小鼠胚胎成纤维细胞中启动子区域大部分被甲基化，但在 诱导干细胞样胚胎干细胞中被去甲基化。这对于每个克隆而言都是正确的。图4b显示了由实时PCR证实的组蛋白H3的乙酰化和甲基化的染色质免疫沉淀分 析。与在mES中相似，0ct4、Sox2和Nanog启动子提高了在B0_iPS细胞中组蛋白H3的乙 酰化(AcH3)，降低了小鼠胚胎成纤维细胞中组蛋白H3的赖氨酸9的去甲基化。图5显示了由DNA微阵列分析得到的全局基因表达谱。mES、MEF和iPS细胞的 Pearson相关分析显示，iPS细胞与mES细胞高度相关，二者之间的相关系数为0. 98，而与 MEF细胞相关性较差，二者之间的相关系数为0. 69 (下图)。全局基因表达谱的散布图显示， BO-iPS细胞及其克隆与MEF细胞有很大不同，但与mES细胞相似。并且，大多数基因的表达 水平在2倍变化范围内，这表明BO-iPS细胞和mES细胞之间基因表达模式的相似性。图6a至图6d显示了体外和体内分化为所有三种胚层。图6a显示了诱导干细胞的胚体(EB)形成，以及由RT-PCR测定的三种胚层的特征 性标记物的表达。图6b显示了由针对三种胚层的典型标记物的免疫细胞化学分析的胚体自发分化 为三种胚层的相应代表性细胞。所述胚体分化为内胚层细胞、中胚层细胞和外胚层细胞，其 特征为GATA4、Bry, SMA和Tujl的表达。图6c显示了诱导体内分化为所有三种胚层。iPS细胞在肾包膜下注射到Balb/c 裸鼠中，8周 10周后，小鼠发育出畸胎瘤，以备H&E染色。图6d显示了当BO-iPS细胞注射入胚泡时嵌合体形成。图7a至图7c显示了 ES细胞和由iPS细胞同源群得到的克隆之间的比较。图7a显示了由RT-PCR所测量的MEF和iPS细胞中对于胚胎干细胞至关重要的主 要基因的表达谱。图7b显示了由免疫细胞化学测量的阳性AP染色和所述克隆上的标记物的检测。图7c显示了在于肾包膜下注射入Balb/c裸鼠后，所述克隆的体内畸胎瘤形成，8 周 10周后，检测到三种胚层。图8是示意图，显示了使用0ct4和toil将成纤维细胞重编程以产生诱导全能干 细胞的新方法。图 9a_9d 显示了经 Shh (sonic hedgehog)处理而诱导 Bmi 1。图IOa-IOe显示了在所述Shh处理下通过导入0ct4基因而产生的iPS细胞与ES 细胞的比较。
图Ila和lib显示了本发明的胚胎干细胞样细胞与胚胎干细胞之间的表观遗传学 比较。图12显示了由DNA微阵列分析得到的全局基因表达谱。由所述全局基因表达谱 的散布图分析，发现BO-iPS细胞在基因表达模式上与mES细胞相似。Pearson相关分析显 示，ES细胞与SO-iPS细胞高度相关，二者之间的相关系数为0. 98。图13a至13c显示了体外和体内分化为所有三种胚层。图1 至14d显示了通过羟基胆固醇(氧甾醇)(Shh类似物)处理的toil的诱导。图1 至15d显示了在氧留醇处理下通过导入0ct4基因而产生的iPS细胞与ES 细胞的比较。图16a和16b显示了本发明的胚胎干细胞样细胞与胚胎干细胞之间的表观遗传学 比较。图17显示了由DNA微阵列分析得到的ES细胞和00_iPS细胞的全局基因表达谱。 由所述全局基因表达谱的散布图分析，发现ΟΟ-iPS细胞在基因表达模式上与mES细胞相似 (上图)。Pearson相关分析显示，ES细胞与S0_iPS细胞高度相关，二者之间的相关系数为 0. 98。诱导干细胞的克隆相对于ES细胞的Pearson相关系数为0. 95。图l&i和18b显示了本发明的胚胎干细胞样细胞体外和体内分化为所有三种胚 层。图19a和19b显示了在应用于小鼠胚胎成纤维细胞的条件下由成体小鼠胚胎成纤 维细胞建立诱导干细胞系(00-iPS-TTF#l和2)，以及它们的性质。图20a和20b显示了由成体小鼠成纤维细胞得到的胚胎干细胞样细胞 (00-iPS-TTF#l和2)的表观遗传学。图21a和21b显示了本发明由成体小鼠成纤维细胞得到的诱导胚胎干细胞样细胞 (00-iPS-TTF#l和2、的体外和体内分化为所有三种胚层的潜能。图22a_22d显示了通过Shh类似物嘌吗啡胺处理进行的toil诱导。图23a_2;3e显示了在嘌吗啡胺处理下将0ct4基因导入而产生的诱导干细胞与胚 胎干细胞的比较。图2 和24b显示了本发明的胚胎干细胞样细胞的表观遗传学。图25显示了由DNA微阵列分析得到的ES细胞和P0_iPS细胞的全局基因表达谱。 由所述全局基因表达谱的散布图分析，发现P0-iPS细胞在基因表达模式上与mES细胞相 似。Pearson相关分析显示，ES细胞与P0_iPS细胞高度相关，相关系数为0. 97和0. 95。图26a_26d显示了本发明的诱导胚胎干细胞样细胞体外和体内分化为所有三种 胚层的潜能。
具体实施例方式为实现本发明，本发明人对体细胞去分化进行了集中深入的研究，以克服现有技 术中遇到的难题，这导致发现当将0ct4与选自Shh或Shh类似物如氧留醇或嘌吗啡胺的重 编程因子组合导入体细胞时，能诱使体细胞进行去分化成为全能胚胎干细胞样细胞。本发明的一方面提供了用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含a) toil (B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1，Bcell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1)蛋白或编码 Bmil 的核酸分子；禾口b)0ct4蛋白或编码0ct4的核酸分子。如本文中所使用，术语“胚胎干细胞(ESC)样细胞”意指以ESC细胞的性质为特征 的全能细胞，所述ESC细胞的性质包括但不限于不转变而增殖、无限复制、自我更新和分化 为所有三种胚层。在上下文中，胚胎干细胞样细胞可以与胚胎干细胞或诱导全能干细胞交 换使用。当诱导产生胚胎干细胞样细胞时，对于起始体细胞没有特别限制。只要所述体细 胞被诱导进行去分化，可以采用任何体细胞。例如，可以采用胚胎时期的体细胞或成熟体细 胞。当所述胚胎干细胞样细胞应用于疾病治疗时，理想的是它们源自患者的体细胞，例如与 疾病相关或者参与疾病治疗的体细胞。优选的是，所述体细胞是成纤维细胞，所述成纤维细 胞可分离自动物，优选分离自哺乳动物，包括人、小鼠、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等。根据本发明的实施方式，toil和0ct4可以为蛋白形式，也可以为核酸分子形式。 可用于本发明的toil和0ct4的实例包括来自于动物，例如人、小鼠、马、绵羊、猪、山羊、骆 驼、羚羊、狗等的那些toil和0ct4，优选人toil和0ct4。此外，用于去分化为胚胎干细胞 样细胞的toil和0ct4蛋白可具有其野生型氨基酸序列或变体。Bmil和0ct4蛋白变体指这样的蛋白由于在一个或多个氨基酸残基处的缺失、插 入、非保守或保守替换或它们的组合而与野生型蛋白在氨基酸序列上存在差异，但仍保持 与之等同的生物和功能性，并且生理化学性质上发生改变或未发生改变。如果发生改变，所 述变体在面对物理和化学条件时可具有更高的结构稳定性以及更高的生理活性。在本发明的优选实施方式中，anil和0ct4提供为编码所述蛋白的核苷酸序列。所述核苷酸序列可编码aiii 1和0ct4的野生型或变体蛋白，并可以在一个或多个 核苷酸残基处经替代、缺失、插入或其组合而进行改变。它们可以经天然分离或者化学合 成。编码anil和0ct4的核苷酸序列可以是单链或双链形式的DNA分子(基因组DNA、 cDNA)或RNA分子。根据本发明的优选实施方式，用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细 胞的组合物还包括携带并表达toil和0ct4基因的载体。在本文中所使用的术语“载体”指DNA构建体，其中感兴趣的基因可操作地与调节 元件相连，从而使得所述基因能在其中带有所述载体的适当宿主中表达。本文中所使用的术语“可操作地相连”意指调节元件和编码感兴趣的蛋白的核苷 酸序列之间以所述元件能用于启动并调控核苷酸序列转录的功能性关系进行的功能性连 接。在重组载体中，所述功能性连接可以采用本领域中已知的基因重组技术得到。使用典 型酶能实现位点特异性DNA切割和连接。根据本发明的目的，本发明所用载体的调节元件可以包括用于膜靶定或分泌的信 号序列或前导序列，以及表达调节元件如启动子、操纵子和起始密码子、终止密码子、聚腺 苷酸化信号和增强子。所述启动子可以是组成型(constitutive)或诱导型(inducible)。 此外，所述表达载体可以含有选择标记，从而选取其转化的宿主细胞。如果表达载体可复制，所述表达载体将含有复制起始点。所述载体可以自我复制或者可以整合到宿主细胞的 染色体中。可用于本发明的载体有质粒、粘粒和病毒载体，优选病毒载体。病毒载体的实例包 括但不限于由逆转录病毒诸如HIV (人类免疫缺陷病毒),MLV (鼠白血病病毒)、ASLV (禽肉 瘤/白血病)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳氏肉瘤病毒)和MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)、腺 病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒得到的那些病毒载体。在本发明的一个实施方式中，Bmi 1 基因插入到PBbe puro载体中，即带有嘌呤霉素选择标记的基于MLV (莫洛尼白血病病毒) 的病毒载体，并采用PBabe neo载体来携带和表达0ct4基因，该pBabe neo载体是含有新 霉素选择标记的基于MLV的病毒载体。在本发明中，采用本领域中已知技术可以将编码anil和0ct4的核苷酸序列引入 到宿主细胞中，诸如以裸DNA载体的形式(Wolff et al. , Science, 1990 =Wolffet al. J Cell Sci. 103:1^9-59，1992)或由脂质体或阳离子聚合物协助。脂质体是用于基因转移 的磷脂膜，由诸如DOTMA和DOTAP等阳离子磷脂的混合物构成。当阳离子脂质体与阴离子 核酸分子以一定的比例混合时，形成适用于跨细胞膜基因转移的核酸-脂质体复合体。根据本发明的另一优选实施方式，用于对体细胞重编程以形成胚胎干细胞样细胞 的组合物还包括锚定和表达编码Bmil和0ct4的核苷酸序列的病毒。在本文中，术语“病毒”是通过用携带编码anil和0ct4的基因的病毒载体转染和 感染包装细胞而制备的。可在表达anil和0ct4的病毒制备中使用的病毒的实例包括但不限于逆转录病 毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯性疱疹病毒，并优选逆转录病毒。在本发明的实施方式中， 通过将Bmil编码核苷酸序列(SEQ IDN0. 1)插入到pBabe puro载体构建的pBabe puro toil载体和通过插入0ct4编码核苷酸序列(SEQ ID N0. 2)构建的pBabe neo 0ct4载体 转染到PT67包装细胞系中以产生可表达toil和0ct4的病毒，随后将病毒用于感染成纤维 细胞。由PT67细胞包装的病毒显示出高病毒滴度并且能用于感染较宽范围的哺乳动物细 胞。根据本发明的再一个方面，本发明提供了由体细胞产生胚胎干细胞样细胞的方 法，该方法包括将anil(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)基因和0ct4基因导 入体细胞。更具体而言，所述方法包括(i)在培养基中培养成纤维细胞；(ii)将各自携带 anil基因和0ct4基因的载体转染入包装细胞，用所述包装细胞感染所述成纤维细胞；和 (iii)在用于培养胚胎干细胞的条件下培养所感染的成纤维细胞。在步骤(i)中使用的培养基是通常用于培养成纤维细胞的培养基。通常，所述 培养基含有碳源、氮源和痕量元素。在本发明的优选实施方式中，成纤维细胞在补充有 10% FBS (胎牛血清)、0. ImM非必需氨基酸、青霉素/链霉素和0. ImM β-巯基乙醇的 DMEM(高葡萄糖，不含有丙酮酸钠)中培养。在步骤(ii)中，通过将toil编码核苷酸序列插入到pBabe puro载体构建的pBabe puro Bmil载体和通过将0ct4编码序列(SEQ ID NO. : 插入pBabe neo载体构建的pBabe neo 0ct4载体被转染到可产生能感染多种哺乳动物宿主细胞的高滴度病毒的包装细胞中， 从而形成随后可用于感染成纤维细胞的病毒。Bmil和0ct4或编码它们的核苷酸序列可以是得自于动物，如人、小鼠、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等的野生型序列或其变体。在 优选实施方式中，采用人Bmil(NCBI登记号No. L13689 ;SEQ ID NO. :1)和人0ct4(NCBI登 记号 No. NM_002701 ；SEQ ID NO. :2)。步骤(iii)中可以采用任何培养基，只要该培养基常用于培养胚胎干细胞即可。 在优选实施方式中，在饲养细胞存在下，受感染的成纤维细胞在补充有15%FBS(胎牛血 清)+0. ImM非必需氨基酸+1%青霉素/链霉素+0. ImM β-巯基乙醇+1000单位/ml小鼠 LIF (白血病抑制因子)的高葡萄糖DMEM中进行培养，每两天或三天传代一次。本发明的再一个方面提供了由本发明方法制备的胚胎干细胞样细胞。发现由本发明的方法制备的胚胎干细胞样细胞对于抗胚胎干细胞标记物碱性磷 酸酶、SSEA-U 0ct4和Sox2的抗体有阳性反应，并且以与胚胎干细胞相似的方式表达对保 持胚胎干细胞的自我更新非常关键的基因(0Ct4、SOX2、NanOg、C-myC、Klf4)。此外，本发明 的胚胎干细胞样细胞展现出与典型胚胎干细胞一样的全能性。而且，本发明的胚胎干细胞 样细胞的特征在于自我更新。因此，本发明的胚胎干细胞样细胞可用作各种类型细胞的来源。例如，当在用于 细胞分化的条件下培养时，所述胚胎干细胞样细胞可被诱导分化为造血细胞、神经元、β细 胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道上皮细胞及其类似细胞。关于用于胚胎干细胞分化的条件、培养基和方法，可参考I^alacios等，PNAS. USA, 92 :7530-7537 (1995)、Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev.，6 ；543-552 (1994)和 Bain 等·， Dev. Biol，168 :342-357 (19卯)。通过植入，所述胚胎干细胞可用于治疗大量疾病，包括 糖尿病、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癌症、脊髓损伤、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症 (卢伽雷氏症)、肌肉营养不良、肝病、高胆固醇血症、心脏病、软骨疾病、创伤、足部溃疡、胃 肠功能紊乱、血管疾病、肾脏疾病、子宫疾病、衰老有关的疾病等。此外，本发明的胚胎干细 胞样细胞能用于药物评价。本发明的又再一个方面提供了由体细胞产生诱导神经干细胞的方法，所述方法包 括将aiiil(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)基因导入所述体细胞，和在用于 培养神经干细胞的条件下培养所述体细胞。通过特异性标记物(Nestin和Sox2)的检测，鉴定体细胞去分化为神经干细胞。当 置于典型分化条件下时，通过针对相应标记(GFAP、Tujl和04)的免疫化学染色测定，发现 所述诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。本发明的再一个方面提供了用于对体细胞重编程以形成胚胎干细胞的组合物，所 述组合物包含a)选自(Sonic Hedeghog信号)蛋白、Shh编码核酸分子、氧留醇、嘌吗啡胺及 其组合的anil上游调节子；和b)0ct4蛋白或0ct4编码核酸分子。toil由上游调节子Sih(sonic hedgehog)信号传递路径调节。如果采用Shh或 Shh类似物的试验可提供与通过Bmil过表达系统所得相似的结果，则有可能减少用于重编 程的基因的数量。迄今，未见报道公开利用单一基因由成纤维细胞产生诱导PS细胞。因 此，该方法可产生用于诱导去分化的新方法，并且进一步产生作为提供无需导入基因而形 成iPS细胞的方法的基础的技术。
该设想使得可利用Shh信号传导路径来使anil过表达。经报道，在神经干细胞 的自我更新中起到重要作用的细胞因子aih，直接影响Giii转录并上调神经干细胞的主要 因子 Bmil 和 Sox2 的表达(Curr MolMed. 9,873-886,2009 ；Crit Rev Oncol Hematol. 65， 43-53,2008)。利用这些报道中所含的知识，本发明人在学术文章中公开了 Bmil的导入可 诱导星形胶质细胞重编程为神经干细胞，其内容已获得专利权。并且，发现Shh诱导去分 化。所述文章的内容已获得专利权。当转移到用于神经干细胞的培养条件中时，已转染有 toil基因的鼠成纤维细胞重编程为神经干细胞，通过神经干细胞的特征性标记物nestin 和Sox2的表达监测了该过程。此外，通过针对各自特异性标记物的免疫染色测定，发现诱 导神经干细胞分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。另外，诱导toil表达的Sih 处理确实启动了由体细胞产生诱导神经干细胞。基于此，用Shh处理的同时引入0ct4，随后在胚胎干细胞的条件下培养建立了胚 胎干细胞样细胞，发现所述胚胎干细胞样细胞在基因表达谱、表观遗传学、体外和体内分化 为所有三种胚层和畸胎瘤形成方面高度类似小鼠胚胎干细胞。根据本发明的一个实施方式，Shh和Oct可以是蛋白形式，也可以是核酸分子形 式。可用于本发明的Shh和0ct4的实例包括来自动物，例如人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚 羊、狗等的那些Shh和0ct4，优选人Shh和0ct4。此外，可用于去分化为胚胎干细胞样细胞 的Shh和0ct4蛋白可以具有其野生型氨基酸序列或其变体。Shh和0ct4蛋白变体指这样的蛋白由于在一个或多个氨基酸残基处的缺失、插 入、非保守或保守替换或它们的组合而具有不同于野生型蛋白的氨基酸序列，但仍保持与 之等同的生物功能，并且生理化学性质上发生改变或未发生改变的蛋白。如果发生改变，所 述变体在面对物理和化学条件时可具有更高的结构稳定性以及更高的生理活性。优选为，Sih以蛋白形式提供。例如，通过用Shh蛋白处理其培养基，可将体细胞 重编程为胚胎干细胞样细胞。除了诱导anil表达，Shh如果以蛋白形式提供，还能减少因 重编程而导入的基因数量。在培养基中应当含有有效量的Shh蛋白。Shh蛋白的有效量可根据如培养基种类、 培养方法等已知因素而变化。在本发明的优选实施方式中，Shh的用量为500ng/ml。在本发明的一个实施方式中，Shh和0ct4以编码所述蛋白的核苷酸序列形式提{共。所述核苷酸序列可以编码Shh和0ct4的野生型或变体蛋白，并且可由于替换、缺 失、插入或它们的组合而具有一个或多个被改变的核苷酸残基。它们可以从自然界分离或 者化学合成。编码Shh和0ct4的核苷酸序列可以是单链或双链形式的DNA分子(基因组DNA、 cDNA)或RNA分子。根据本发明的优选实施方式，用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细 胞的组合物还包括携带和表达Shh和0ct4基因的载体。根据本发明的再一个优选实施方式，用于对体细胞重编程以形成胚胎干细胞样细 胞的组合物还包括Shh蛋白以及锚定和表达编码0ct4的核苷酸序列的病毒。作为替代性方式，可以采用Shh类似物，诸如羟基胆固醇(氧留醇)或嘌吗啡胺替 代SHh以诱导Shh信号(Stem cells 27，703-713，2009)。在神经干细胞的培养条件下，观察到用氧甾醇或嘌吗啡胺对小鼠胚胎成纤维细胞的处理诱导toil表达水平的提高以及随 之Sox2表达水平的提高。同时，均为anil标靶的Pie1nk4a和？19^被下调。因此，用氧甾 醇或嘌吗啡胺处理诱导了 anil和Sox2的上调以及anil的标靶基因的下调。观察到通过 用氧留醇或嘌吗啡胺处理诱导的细胞具有与神经干细胞相似的形态，并且表达神经干细胞 的特征性标记nestin和sox2。这些结果与toil过表达的情形中发生的相同，表明Shh类 似物氧留醇或嘌吗啡胺能用以诱导体细胞进行去分化成为胚胎干细胞样细胞。该方法同样 具有减少为重编程而导入的基因数目的优点。用Shh类似物处理的同时引入0ct4，随后在 用于胚胎干细胞的条件下培养建立了胚胎干细胞样细胞，发现所述胚胎干细胞样细胞在形 态、基因表达谱、表观遗传学、体外和体内分化为所有三种胚层、畸胎瘤形成和嵌合小鼠形 成等方面高度类似小鼠胚胎干细胞。氧留醇是可用于本发明的Shh类似物，也称之为羟基胆固醇，是胆固醇的氧化衍 生物。据报道氧留醇在包括急性和慢性炎症、胆石病、胆管癌等胆疾病的病理生理学中起到 重要作用。最近报道在脑发育过程中产生多巴胺的神经元的形成取决于氧留醇对脑中特异 受体的激活。然而在之前的文献中并没有报道氧留醇在通过去分化形成胚胎干细胞样细 胞中的应用。对于用于本发明的氧甾醇并没有任何特殊限制。只要能发挥作用诱导Shh信 号，任何羟基胆固醇均可用作在本发明中有用的Shh类似物。例如，可以采用市售的25-、 7 β -和19-羟基胆固醇作为Shh类似物。可以通过用氧留醇处理其培养基，来将体细胞重编程为神经干细胞样细胞。除了 诱导anil表达，氧甾醇还能减少因重编程而导入的基因数量。在培养基中应当含有有效量的氧留醇。氧留醇的有效量可根据诸如培养基种类、 培养方法等已知因素而变化。在本发明的优选实施方式中，氧甾醇以0. 1 μ M至0. 5 μ M的 量使用。嘌吗啡胺是嘌呤化合物，参与Shh信号传递路径。只要能够诱导Shh信号，可以在本发明中使用任何嘌吗啡胺衍生物，而并没有特 别限制。例如，可以使用市售的2-(1-萘氧基)-6- -吗啉代苯胺)-9-环己基嘌呤。而已通过用嘌吗啡胺处理其培养基，来将体细胞重编程为神经干细胞样细胞。除 了诱导anil表达，嘌吗啡胺还能减少因重编程而导入的基因数量。在培养基中应当含有有效量的嘌吗啡胺。嘌吗啡胺的有效量可根据诸如培养基种 类、培养方法等已知因素而变化。在本发明的优选实施方式中，嘌吗啡胺以0. 5 μ M至1 μ M 的量使用。根据本发明的再一个方面，本发明提供了用于将体细胞重编程以形成胚胎干细胞 样细胞的方法，所述方法包括用选自Shh(SonicHedeghog)、Shh编码核苷酸序列、氧甾醇、 嘌吗啡胺及其组合的Bmil上游调节子处理所述体细胞，和将0ct4基因导入所述体细胞。更具体而言，所述方法包括⑴在培养基中培养成纤维细胞；(ii)用选自 Shh(Sonic hedgehog)、Shh编码核苷酸序列、氧甾醇、嘌吗啡胺及其组合的toil上游调节 子处理所述体细胞，同时用转染有携带0ct4基因的载体的包装细胞来感染所述体细胞；和 (iii)在用于培养胚胎干细胞的条件下培养所述受感染的成纤维细胞。在步骤(i)中使用的培养基是通常用于培养成纤维细胞的培养基。通常，所述培养基含有碳源、氮源和痕量元素。在本发明的优选实施方式中，成纤维细胞在补充有 10% FBS(胎牛血清)、0. ImM非必需氨基酸、青霉素/链霉素和0. ImM β-巯基乙醇的 DMEM(高葡萄糖，不含有丙酮酸钠)中培养。在步骤(ii)中，优选将0ct4基因导入成纤维细胞，同时通过在神经干细胞的培 养条件下用aih、氧留醇或嘌吗啡胺处理将所述成纤维细胞重编程为神经干细胞。对此，将 成纤维细胞用氧留醇或嘌吗啡胺处理一天，此后在持续用aih、氧留醇或嘌吗啡胺处理的同 时，以16小时的定期间隔用0ct4病毒进行感染三次。在用aih、氧甾醇或嘌吗啡胺处理总 时间72小时的同时，培养条件由适用于神经干细胞的条件变化为适用于胚胎干细胞的条 件以提高重编程效率。在步骤(ii)中，通过将0ct4编码核苷酸序列插入到pBabe neo载体而构建的 pBabe neo 0ct4被转染到可产生能感染多种哺乳动物宿主细胞的高滴度病毒的PT67包装 细胞中，从而形成随后用于感染进入成纤维细胞的病毒。Shh和0ct4或编码它们的核苷 酸序列可以是得自于动物例如人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等的野生型序列或其变 体。在优选实施方式中，采用人0ct4(NCBI登记号No. NM_002701 ;SEQ IDNO. :2)。步骤(iii)中可以采用任何培养基，只要该培养基常用于培养胚胎干细胞即可。 在优选实施方式中，在饲养细胞存在下，受感染的成纤维细胞在补充有15%FBS(胎牛血 清)+0. ImM非必需氨基酸+1%青霉素/链霉素+0. ImM β-巯基乙醇+1000单位/ml小鼠 LIF (白血病抑制因子)的高葡萄糖DMEM中进行培养，每两天或三天传代一次。根据本发明的再一个方面，提供了由本发明的方法制备的胚胎干细胞样细胞。发现由本发明的方法制备的胚胎干细胞样细胞对对抗胚胎干细胞标记物碱性磷 酸酶、SSEA-l、0ct4和Sox2的抗体有阳性反应，并且以与胚胎干细胞相似的方式表达对保 持胚胎干细胞的自我更新非常关键的基因(0Ct4、SOX2、NanOg、C-myC、Klf4)。此外，本发明 的胚胎干细胞样细胞展现出与典型胚胎干细胞一样的全能性。通过以下实施例能更好地理解本发明，所述实施例为阐述而被描述，但不应解释 为是对本发明的限制。实施例实施例1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养以及其中0ct4和toil的导入使用小鼠胚胎成纤维细胞来形成胚胎干细胞样细胞。于13. 5个胚胎日由CFl系 小鼠取得胚胎。于组织培养瓶中，细胞在补充有10% FBS(胎牛血清)、0. ImM非必需氨基 酸、青霉素/链霉素和0. ImM β-巯基乙醇的DMEM(高葡萄糖，不含丙酮酸钠)中培养， 其后，第三代传代的成纤维细胞以2X IO5细胞/孔的密度接种在6孔板中。为用于基因转移，由ΡΤ67包装细胞系制备逆转录病毒颗粒。对此，将人toil 基因(NCBI登记号No. L13689)插入pBabe puro载体而构建的pBabe puro Bmil (来自 于 Dr. G. P. Dimri, Evanston NorthwesternHealthcare Research Institute, Feinberg School of Medicine, NorthwesternUniversity, Evanston, IL 60201, USA)禾口)人 0ct4 基因(NCBI登记号No. NM_002701)插入pBabe neo载体而构建的pBabe neo 0ct4载体，在 Turbofect (Fermentas)的辅助下，转染到PT67包装细胞系(Clontech)，随后用嘌呤霉素 (3μ g/ml, BD bioscience)和新霉素(1000yg/ml，BDbiosciences)进行药物选择。所述 PT67包装细胞系使得可以产生能感染多种哺乳动物宿主细胞的高滴度病毒。
各基因的表达由RT-PCR进行监控。当细胞生长至80%聚满(confluency)时，取上 清液，经0.45 μ m过滤器(Millipore)过滤以除去细胞碎片，并在聚凝胺(6 μ g/ml, sigma) 存在下加入到细胞中。以12小时的定期间隔重复感染三次。实施例2 通过导入0ct4、Sox2和toil基因进行重编程通过将两种基因0ct4和Sox2 (2F)或三种基因0ct4、Sox2和Bmil (2F-Bmil)引 入小鼠胚胎成纤维细胞而诱导重编程，并比较结果。在进行实施例1的逆转录病毒转导之后，在小鼠胚胎干细胞的培养条件下诱导细 胞进行重编程。为此，在饲养细胞存在下，在补充有15% FBS (胎牛血清)、0. ImM非必需氨 基酸、青霉素/链霉素、0. ImM β-巯基乙醇和1000单位/ml小鼠LIF(白血病抑制因 子)的高葡萄糖DMEM中分培养细胞，每2至3天传代一次。图1显示了导入0ct4和Sox2基因，以及导入0ct4、Sox2和Bmil基因时的重编程 效率。如图Ia中所见，由编码toil基因和两种因子基因(0ct4和Sox2) (2F-Bmil)的逆转 录病毒感染的细胞远比由编码两种因子基因OF)的逆转录病毒感染的细胞产生更多数量 的AP阳性集落。观察到所建立的iPS细胞具有与胚胎干细胞相似的形态(图lb)。进行 AP染色以检验经重编程的细胞是否表达胚胎干细胞的特征性标记物。同样，由免疫染色测 量发现SSEAl、0ct4、Sox2和Nanog的表达(图Ic)。这些数据表明随着0ct4、Sox2和Bmil 的导入，体细胞能进行重编程，Bmil在所述重编程中起到关键作用。实施例3 通过anil基因引入将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为神经干细胞样细胞当如实施例1对小鼠胚胎成纤维细胞进行逆转录病毒转导时，通过蛋白印迹分析 测定发现anil标靶基因Pie1nk4a和pl9arf表达水平降低，而Sox2表达提高(图加)。当在适于神经干细胞的培养基中培养anil转导细胞时，观察到它们聚集并改变 形态为神经球形态(图2b)。针对神经干细胞典型标记物Nestin和Sox2，用AP染色和免 疫化学对这些细胞进行分析。同样，经针对分别为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞典 型标记物的GFAP、Tujl和04的免疫化学染色测定，Bmil转导细胞与神经干细胞相似地分 化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。因此，toil基因的导入诱导小鼠胚胎成纤维 细胞经历重编程过程而成为神经干细胞样细胞。实施例4 通过导入0ct4 Bmil基因形成诱导PS细胞考虑到toil转导小鼠胚胎成纤维细胞具有提高的Sox2表达水平，并且重编程为 神经干细胞的结果，单独用0ct4和anil基因诱导重编程过程。与单独用0ct4未产生集落 相比，用toil和0ct4进行重编程使得出现约50个与胚胎干细胞形态相似的集落(图3a)。 经RT-PCR和实时PCR测量，发现这些建立的iPS细胞(BO-iPS)表达胚胎干细胞特异性基因 (图北和3c)。同样，在BO-iPS上检测到阳性AP染色以及SSEA1、0ct4和Sox2免疫反应 活性(图3d)。将由胚胎干细胞(ES)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和诱导干细胞(BO-iPS) 得到的蛋白进行蛋白印迹分析以检测胚胎干细胞特征性标记物0ct4和Sox2，并且FACS分 析显示了 SSEAl和0ct4的表达(图!Be和3f)。图3的数据表明，在BO-iPS中没有表达外 源性0ct4基因。DNA PCR(基因组DNA PCR)揭示0ct4基因整合到BO-iPS的基因组DNA 中。实施例5 :B0-iPS和ES中主要基因启动子的甲基化检验在诱导干细胞、胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中检验了对于胚胎干细胞的自我更新至关重要的基因的启动子。进行亚硫酸氢盐测序以测验0ct4和Nanog启动子区域 的甲基化状态。发现在小鼠胚胎成纤维细胞中它们大部分被甲基化，而在诱导干细胞中则 与胚胎干细胞中相似地被去甲基化。这些结果对于同源性克隆都是正确的(图如)。染色 质免疫沉淀分析显示0ct4、Sox2和Nanog启动子提高了 ES和B0_iPS中组蛋白H3的乙酰 化，以及MEF中K9位置处的去甲基化(图4b)。实施例6 胚胎干细胞和诱导干细胞中基因表达的DNA微阵列检验通过微阵列检验测试了胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和诱导干细胞中基因表 达谱，并表示为散点图，显示出在对于胚胎干细胞的自我更新至关重要的基因的表达谱方 面，诱导干细胞与胚胎干细胞相似，而与小鼠胚胎成纤维细胞不同。同源克隆也表现出诱导干细胞和胚胎干细胞之间的相似模式。0. 98的Pearson相 关系数证实了诱导干细胞和胚胎干细胞之间的高相关性(图5)。实施例7 :B0-iPS的分化潜能和嵌合体形成通过胚体分析测试了 BO-iPS细胞的体外分化潜能。RT-PCR显示BO-iPS以与ES相 似的模式表达三种胚层的基因(图6a)。通过相应的特征性标记物染色测量，发现由BO-iPS 细胞得到的胚体分化为对应于三种胚层的典型细胞。在本文中，用Tujl、bry、SMA和GATA4 进行免疫化学，表明BO-iPS细胞具有与ES细胞相同的体外分化潜能(图6b)。为了研究BO-iPS细胞体内分化潜能，对其检测了畸胎瘤形成。IX IO6细胞于 SOOOrpm离心5分钟，由此得到的团块在用于胚胎干细胞的增殖培养基中培养M小时，随后 将这些细胞于肾包膜下注入6周龄的Balb/c裸鼠的脊侧。8周至10周后，切除肾脏，以石 蜡包埋并进行H&E染色。结果显示BO-iPS细胞分化为对应于三种胚系的细胞。将所述细 胞注入C57/BL6的胚泡。将经注入的胚泡转移到代孕雌鼠中。嵌合小鼠于Fl出生。通过 比较代孕小鼠和C57/BL6小鼠证实了嵌合体形成(图6d)。这些结果证实了 BO-iPS具有与 ES细胞相似的性质。实施例8 :B0-iPS细胞同源群是否具有与ES细胞相似性质的测验为了研究BO-iPS细胞同源群是否显示出与ES细胞相同的性质，制造了单细胞克 隆。对5个BO-iPS克隆检验分析了对于ES细胞至关重要的基因的表达。通过RT-PCR检 测到二者之间相似的表达谱(图7a)。在所述克隆中检测到阳性AP染色以及SSEA1、0ct4 和Sox2免疫反应性(图7b)。此外，通过H&E染色鉴别了克隆的畸胎瘤形成(图7c)。图8是示意图，在证实本发明的设想的数据基础上进行设计，显示了将体细胞重 编程从而产生诱导全能干细胞的新方法。新型重编程因子Bmil与0ct4基因的组合引入使 体细胞能进行重编程过程。此外，采用上游调节子替代Bmil享有减少重编程因子数量的优 点，并且能深入理解无需导入基因即可产生诱导全能干细胞的技术。实施例9 通过Shh或Shh类似物处理进行toil表达，以及0ct4基因引入对实施例1中制备的成纤维细胞测试它们在以Sih或其类似物，诸如氧留醇或嘌 吗啡胺处理时的toil表达。图9a、Ha和2 是显示已知为toil上游调节子的Shh (Sonic hedgehog)或其类似物对其下游基因表达的作用的RT-PCR结果。在神经干细胞培养条件 (DMEM/F12+B27+N2+1%青霉素/链霉素+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)下，用 500ng/mlShh、 0. 1 μ M和0. 5 μ M羟基胆固醇(Sigma，25-羟基胆固醇，Η1015)、或0. 5 μ M或1 μ M嘌吗啡胺 (Calbiochem cat. no. 540220)处理，可导致 Glil 和 Bmil 的上调和 Bmil 标靶基因 pl6Ink4a和pl9Arf&下调。同样，观察到细胞聚集并改变其形态为神经元的形态(图9b、14b和22b)。经AP染 色和针对SSEAl、Nestin和Sox2的免疫化学分析，所述诱导神经干细胞样细胞为阳性(图 9cU4c和22c)。因此，经Shh处理的细胞表现出与toil转导细胞相似的性质。为了用于将0ct4基因导入经Shh或其类似物羟基胆固醇或嘌吗啡胺处理的 成纤维细胞，由PT67包装细胞系制备逆转录病毒颗粒。就此而言，通过将人0ct4基 因(NCBI登记号No. NM_002701)插入pBabe neo载体而构建的pBabe neo 0ct4载体在 Turbofect (Fermentas)的协助下转染到PT67包装细胞系(Clontech)中，随后用新霉素 (1000 μ g/ml,BDbiosciences)进行药物选择。所述PT67包装细胞系可以产生能感染广泛 哺乳动物宿主细胞的高滴度病毒。0ct4的表达由RT-PCR进行监控。当细胞生长至80%聚满(confluency)时，取上 清液，经0.45 μ m过滤器(Millipore)过滤以除去细胞碎片，并在聚凝胺(6 μ g/ml, sigma) 存在下加入到细胞中。以16小时的定期间隔重复感染三次。使用逆转录病毒系统，以16小时定期间隔，总共48小时的时间将0ct4基因三次 导入成纤维细胞，同时用aih、羟基胆固醇或嘌吗啡胺处理所述细胞。该处理持续总时间为 72小时。在处理期间，保持神经干细胞培养条件。其后，将条件改变为用于胚胎干细胞的条 件以诱导重编程过程。图9d、14d和22d是显示用aih、羟基胆固醇或嘌吗啡胺处理、0ct4 基因转导和在用于胚胎干细胞的条件中培养的重编程方案的示意图。该方案基于适用于用 0ct4和Sox2进行基因导入和化学处理的常规方案，但如本文所述比常规方案更先进。在所 述重编程过程进行10天至14天后，出现形态与ES细胞相同的集落。实施例10 通过0ct4导入并同时用Shh或其类似物处理而建立iPS细胞根据实施例9中所提出的方案，通过0ct4的逆转录病毒转导并同时用Shh或其类 似物羟基胆固醇或嘌吗啡胺进行处理，随后在用于小鼠胚胎干细胞的条件下培养，从而建 立iPS细胞。这些条件使得细胞在饲养细胞存在下，在补充有15% FBS (胎牛血清)、0. ImM 非必需氨基酸、1 %青霉素/链霉素、0. ImM β-巯基乙醇和1000单位/ml小鼠LIF (白血病 抑制因子)的高葡萄糖DMEM中培养，每2天至3天传代一次。在培养10天至14天以后，开 始出现与胚胎干细胞形态相似的集落。由此建立的诱导干细胞分别命名为S0-iPS、00-iPS 禾口 PO-iPS。对SO-iPS细胞进行分析并与胚胎干细胞进行比较。对胚胎干细胞至关重要的基 因的RT-PCR表明，S0-iPS和ES细胞之间的基因表达谱存在相似性(图10a)。通过实时 PCR定量测量，还发现S0-iPS细胞具有与ES细胞相同的对自我更新至关重要的基因的表达 方式(图10b)。在S0-iPS细胞中观察到与ES细胞相似的形态。检测了阳性AP染色。经 免疫化学染色测量，0ct4、SSEAl和Sox2的表达模式也与ES细胞相似(图10c)。蛋白印迹 分析表明了与ES细胞中相同的0ct4表达(图10d)。FACS分析显示0ct4和SSEAl大量表 达，正如它们在ES细胞中一样(图IOe)。对00-iPS细胞进行分析以与胚胎干细胞进行比较。对胚胎干细胞至关重要的基 因的RT-PCR表明，00-iPS和ES细胞之间的基因表达谱存在相似性(图15a)。这对于诱导 干细胞的同源性克隆是正确的(图15a)。蛋白印迹分析检测到0ct4和Sox2的表达(图 15b)。同样，FACS数据显示SSEAl和0ct4表达程度与ES细胞中相似(图15c)。在00-iPS细胞中观察到与ES细胞相似的形态。检测到阳性AP染色。经免疫化学染色测量，0ct4、 SSEAl和Sox2的表达模式也与ES细胞相似。这对于诱导干细胞克隆是正确的(图15d)。对PO-iPS细胞进行分析并与胚胎干细胞进行比较。对胚胎干细胞至关重要的基 因的RT-PCR表明，PO-iPS和ES细胞之间的基因表达谱存在相似性(图23a)。在诱导干 细胞中外源性0ct4基因沉默。DNAPCR(基因组DNA PCR)揭示0ct4基因整合到PO-iPS的 基因组DNA中(图23b)。通过实时PCR定量测量，还发现PO-iPS细胞具有与ES细胞相同 的对自我更新至关重要的基因的表达谱(图23c)。另外，FACS数据显示SSEAl和0ct4表 达程度均与ES细胞中相似(图23d)。在PO-iPS细胞中观察到与ES细胞相似的形态。检 测到阳性AP染色。经免疫化学染色测量，0ct4、SSEAU Sox2和Nanog的表达模式也与ES 细胞相似(图23e)。实施例11 :S0-iPS、00-iPS和P0_iPS的表观遗传学测试与ES细胞进行比较，对S0-iPS、00-iPS和P0_iPS分析0ct4和Nanog (已知对于 ES细胞的自我更新至关重要)的启动子区域的甲基化状态进行分析。亚硫酸氢盐基因组测 序分析显示，相对于亲代成纤维细胞系，在iPS细胞中0ct4和Nanog启动子区域被去甲基 化(图11a、16a和Ma)。染色质免疫沉淀分析揭示了 0ct4、Sox2和Nanog启动子提高了组 蛋白H3的乙酰化，表明基因表达的活化(图llb、16b和Mb)。相反，在小鼠胚胎成纤维细 胞的组蛋白H3的赖氨酸9处检测到去甲基化(图lib、16b和24b)。在ChIP检测分析后， 用0ct4、Sox2和Nanog启动子的相应引物通过实时PCR对数据定量化。实施例12 与ES细胞相比的全局基因表达采用DNA微阵列检验，分析SO-iPS、00-iPS和P0_iPS细胞的全局基因表达，并与 ES细胞作比较。全局基因表达的散点图显示大多数基因的表达在2倍变化范围之内，已知 对于ES细胞至关重要的0ct4、Sox2、Nanog、c-myc、Klf4在诱导干细胞和ES细胞之间以相 似模式进行表达(图12、17和25)。 0. 98的Peasson相关系数证实了 S0-iPS细胞和ES细胞之间的高相关性(图12)。对于00-iPS的克隆观察到与上述相同的结果。0.98的Pearson相关系数指明 00-iPS细胞和ES细胞之间的高相关性。0. 95的系数也证实了克隆之一也与ES细胞高度 相关(图17)。用不同浓度的嘌吗啡胺处理的00-iPS细胞中观察到与上述相同的结果。不同 00-iPS细胞和ES细胞之间的Pearson相关系数经计算为0. 97和0. 95，指明相互之间的高 相关性(图25)。实施例13 体外和体内分化为三种胚系层的检验为了研究S0-iPS细胞的体外分化潜能，首先，对它们进行胚体(EB)形成测试(图 13a、18a和^a)。在EB形成后的第7天，经RT-PCR测量，发现胚体按照与ES细胞相同的 模式表达三种胚层的特征性基因(图13a和^a，右图)。将胚体重新铺板到0. 明胶涂 覆板上。通过用指示的抗体对代表性世系特异性标记物的免疫染色测试自发分化。免疫化 学染色检验检测到S0-iPS细胞中Tujl、bry、SMA和CK18的表达，00-iPS细胞中Nestin、 SMA和CK18的表达，PO-iPS中Tjul和SMA的表达，表明体外分化为三种胚细胞(图13b、 18a 和 26a)。为了研究iPS细胞体内分化潜能，对其检测了畸胎瘤形成。1\106细胞于8000印111离心5分钟，由此得到的团块在用于胚胎干细胞的增殖培养基中于37°C培养M小时，随后 于肾包膜下将这些细胞注入6周龄的Balb/c裸鼠的脊侧。8周至10周后，切除肾脏，以石 蜡包埋并进行H&E染色。结果显示iPS细胞分化为对应于三种胚系的细胞，证实了其畸胎 瘤的形成(图13c、18b和^c)。对于PO-iPS细胞，将它们注入C57/BL6的胚泡。将经注入 的胚泡转移到代孕雌鼠中。嵌合小鼠于Fl出生。通过比较代孕小鼠和C57/BL6小鼠证实 了嵌合体形成(图26d)。这些结果证实了 BO-iPS细胞具有与ES细胞相似的性质。实施例14 通过0ctl4导入并同时用氧甾醇处理由成体小鼠胚胎成纤维细胞建立 iPS 细胞(00-iPS-TTF#l,2)用小鼠胚胎成纤维细胞建立的重编程方法应用于成体小鼠胚胎成纤维细胞。所述 重编程方法也能得到胚胎干细胞样细胞(图19a)，命名为00-iPS-TTF#l和2，其分别为用 0. 1 μ M和0. 5 μ M不同氧甾醇浓度处理而得到。00-iPS-TTF#l和2用AP染色为阳性，并通 过免疫化学染色检验测量发现其表达SSEAl、0ct4、Sox2和Nanog (图19a)。另外，定量实 时PCR显示这些细胞的对自我更新至关重要的基因的表达谱与ES细胞相同(图19b)。实施例15 :00-iPS-TTF#l和2的表观遗传学研究出于与ES细胞进行比较的目的，对00-iPS-TTF#l和2分析0ct4和Nanog(已知 对于ES细胞的自我更新至关重要)的启动子区域的甲基化状态进行分析。亚硫酸氢盐基 因组测序分析显示，相对于亲代成纤维细胞系，在iPS细胞中0ct4和Nanog启动子区域被 去甲基化(图20a)。染色质免疫沉淀分析揭示了 0ct4、Sox2和Nanog启动子提高了组蛋 白H3的乙酰化，表明基因表达的活化(图20b)。实施例16 :00-iPS-TTF#l和2体外和体内分化为三种胚系层的检验为了研究00-iPS-TTF# 1和2的体外分化潜能，首先，测试它们的胚体(EB)形 成。将胚体重新谱板到0.1%明胶涂覆板上。通过用指示的抗体对代表性世系特异性标 记物的免疫染色测试自发分化。免疫化学染色检验检测到Nestin、SMA和GATA4的表达， 表明00-iPS-TTF#l和2能体外形成胚体并体外分化为三种胚细胞(图21a)。为了研究 00-iPS-TTF#l和2的体内分化潜能，重复与ΟΟ-iPS细胞的实验中使用的相同步骤。8周至 10周后，切除肾脏，用石蜡包埋并进行H&E染色。结果显示00-iPS-TTF#l和2细胞分化为 对应于三种胚层的细胞，证实了其畸胎瘤的形成(图21b)。至此所述，0ct4基因与toil基因组合导入，或者0ct4基因伴随Shh或Shh类似 物诸如氧留醇或嘌吗啡胺进行处理而导入，并随后在用于胚胎干细胞的条件下培养，将诱 导体细胞进行去分化成为全能干细胞。在合适的条件下，根据本发明制备的诱导胚胎干细胞样细胞能例如分化为心肌细 胞、产生胰岛素的细胞或神经元，它们因此可用于各种疾病的细胞疗法，包括心功能障碍、 胰岛素依赖性糖尿病、帕金森综合征、脊椎损伤等。因此，对于伴随人类胚胎发生的那些问 题，即人类胚胎死亡和免疫排斥，诱导胚胎干细胞样细胞是有前景的解决方案。此外，由iPS 细胞分化的各种细胞(例如，心肌细胞、肝细胞等)可用作评估化学品、药物、毒素等的医 疗效果或毒性的系统。此外，作为anil上游调节子的Shh蛋白或者Shh类似物诸如氧甾醇或嘌吗啡胺能 替代anil用于将体细胞重编程以产生iPS细胞，从而可以单独用0ct4基因进行转染，这可 减少通常所需要的遗传因子的数目。而且，本发明提供了这样的技术以该技术为基础，能提供无需导入基因即可形成iPS细胞的方法。 尽管出于说明性目的而披露了本发明的优选实施方式，本领域技术人员将能理解 可以进行各种修改、添加和替代，而不会背离在所附权利要求书中所公开的本发明的范围 和精神。
权利要求
1.一种用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含a)anil(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码anil的核酸分子；和b)0ct4蛋白或编码0ct4的核酸分子。
2.如权利要求1所述的组合物，其中通过携带有编码Bmil蛋白的核酸分子的表达载体 表达aiii 1蛋白，和通过携带有编码0ct4蛋白的核酸分子的表达载体表达0ct4蛋白。
3.如权利要求1所述的组合物，其中通过锚定有编码Bmil蛋白的核酸分子的病毒表达 ani 1蛋白，通过锚定有编码0ct4蛋白的核酸分子的病毒表达0ct4蛋白。
4.一种通过把toil (B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)基因和0ct4基因 引入到体细胞中使所述体细胞重编程产生胚胎干细胞样细胞的方法。
5.如权利要求4所述的方法，所述方法包括 (i)在培养基中培养成纤维细胞；( )将各自携带anil基因和0ct4基因的载体转染入包装细胞，用所述包装细胞感染 所述成纤维细胞；和(iii)在用于培养胚胎干细胞的条件下培养所感染的成纤维细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过将编码toil蛋白的核酸分子插入到pBabepuro 载体中从而构建携带有ani 1基因的载体，并通过将编码0ct4蛋白的核酸分子插入到pBabe neo载体中从而构建携带有0ct4基因的载体。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述包装细胞是PT67包装细胞。
8.一种胚胎干细胞样细胞，所述胚胎干细胞样细胞按照权利要求4至7中任一项所述 的方法制备。
9.如权利要求8所述的胚胎干细胞样细胞，所述胚胎干细胞样细胞表现出对碱性磷酸 酶和抗SSEA-1、Oct-4和Sox2的抗体的阳性反应。
10.一种用于对体细胞重编程以形成神经干细胞的方法，所述方法包括将anil (B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)基因导入所述体细胞；和 在用于培养神经干细胞的条件下培养所述体细胞。
11.用于对体细胞重编程以形成胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含a)选自由aih(SoniCHedeghog信号)蛋白、编码Shh蛋白的核酸分子、氧留醇、嘌吗啡 胺及其组合组成的组的重编程因子；和b)0ct4蛋白或编码0ct4蛋白的核酸。
12.如权利要求11所述的组合物，其中通过携带有编码Shh蛋白的核酸分子的表达载 体表达Shh蛋白，和通过携带有编码0ct4蛋白的核酸分子的表达载体表达0ct4蛋白。
13.如权利要求11所述的组合物，其中所述重编程因子选自由Shh蛋白、氧甾醇、嘌吗 啡胺及其组合组成的组，且所述0ct4蛋白通过锚定有编码0ct4蛋白的核酸分子的病毒表 达。
14.一种用于将体细胞重编程以形成胚胎干细胞样细胞的方法，所述方法包括用选自由Sih (Sonic Hedeghog)、Shh编码核苷酸分子、氧留醇、嘌吗啡胺及其组合组成 的组的重编程因子处理所述体细胞；和 v将0ct4基因导入所述体细胞。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法包括 (i)在培养基中培养成纤维细胞；( )用转染有携带0ct4基因的载体的包装细胞感染所述成纤维细胞，同时用选自由 Shh蛋白、Shh蛋白编码核酸、氧留醇、嘌吗啡胺及其组合组成的组的重编程因子处理所述 成纤维细胞；和(iii)在用于培养胚胎干细胞的条件下培养所感染的成纤维细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中在用于培养神经干细胞的条件下，通过将所述 0ct4基因转导入所述成纤维细胞，并同时用选自由Shh蛋白、氧留醇和嘌吗啡胺组成的组 的重编程因子处理所述成纤维细胞从而进行步骤(ii)。
17.—种胚胎干细胞样细胞，所述胚胎干细胞样细胞按照权利要求14至16中任一项所 述的方法制备。
全文摘要
本发明涉及用于使体细胞重编程以形成胚胎干细胞样细胞的组合物，以及利用所述组合物形成胚胎干细胞样细胞的方法。所述组合物包含a)Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1的核酸分子；和b)Oct4蛋白或编码Oct4的核酸分子。除了减少通常所需的遗传因子数目之外，所述组合物和方法使得能够形成在各种疾病的细胞疗法中具有较高潜在功用的全能胚胎干细胞样细胞。
文档编号C12N5/071GK102115760SQ201010528609
公开日2011年7月6日 申请日期2010年10月28日 优先权日2009年12月30日
发明者全恩暻, 刘承权, 尹炳善, 文哉喜, 李重翰, 许峻硕, 金俊成 申请人:高丽大学校产学协力团