专利名称：一种克隆水稻抗稻瘟病基因的方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种克隆水稻抗稻瘟病基因的方法。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要食 物。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达11% 30%， 严重时减产达40% 50%，甚至颗粒无收。实践证明，利用抗病水稻品种是应对稻瘟病危害的有效办法之一。到目前为止， 在水稻中定位的抗稻瘟病基因有近百个，已经克隆的有14个，它们分别是Pib，Pita, Pi9， Pid2, Pizt, Pi2, Pi36, Pi37, Pi-km, Pi5, Pid3, Pbl, Pit, Pi_kh，其中除了基因 Pid2 编码 一个丝苏氨酸受体类似激酶外，其他13个抗稻瘟病基因全都属于Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat (NBS-LRR)基因家族。NBS-LRR基因由N端保守的核苷酸结合位 点(NBS)和C端富亮氨酸重复(LRR)区域构成，在LRR区域，由数十个(一般15 40个) 不完全的LRR结构构成。尽管目前已经克隆了 14个抗稻瘟病基因，但由于稻瘟病菌小种众 多而且变异速度快，为了更好应对稻瘟病的危害，克隆更多的抗稻瘟病基因就显得尤为重 要。目前，对抗稻瘟病基因的克隆还是主要依靠图位克隆，虽然籼稻9311和粳稻日本 晴都有了全基因组序列，为水稻基因的图位克隆带来了巨大方便，但对于抗稻瘟病基因的 克隆来说，依然还存在很多困难。比如对精细定位群体内各单株的抗稻瘟病鉴定，不仅工作 量巨大，而且在田间稻瘟病发病情况还很容易受环境影响，造成性状统计错误，而不能准确 定位；另外，从已经测序的9311和日本晴基因组序列来看，NBS-LRR基因大多都是成簇存 在，即使能够将目标基因定位到某一区段，也很难判断成簇基因中的那一个才是真正的抗 病基因；再者，目前利用的水稻品种遗传背景狭窄，可利用的抗稻瘟病基因不多，而在野生 稻中却蕴含着丰富的抗稻瘟病基因，然而，由于对野生稻的研究目前还在起步阶段，没有精 细的遗传图谱和物理图谱，要利用图位克隆其中抗稻瘟病基因显然更是困难重重。基于对目前已经克隆的抗稻瘟病基因信息分析，14个基因中有13个属于NBS-LRR 类基因家族，有理由相信，水稻中抗稻瘟病基因绝大多数应该是属于NBS-LRR基因家族。 目前，一般认为是变异较大的LRR结构域决定了此类抗病基因对病原菌识别的专化性，而 NBS-LRR类基因在植物基因组中又是广泛存在，在已经测序的水稻和拟南芥中，NBS-LRR基 因均占了所有编码基因数目以上。在水稻与稻瘟病菌协同进化过程中，众多的NBS-LRR 基因的存在为水稻抗稻瘟病基因根据病菌小种变化而通过复制，重组等方式产生新的抗病 基因提供了便利。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种克隆抗稻瘟病基因的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤
1)根据已知的抗稻瘟病基因设计引物，得到引物对；2)以对稻瘟病菌高抗水稻基因组DNA为模板，用步骤1)得到的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物；3)将步骤2)得到的PCR扩增产物进行测序，得到抗稻瘟病基因；4)将抗稻瘟病基因转入易感稻瘟病水稻，得到转基因水稻，对转基因水稻进行稻 瘟病的抗谱测定，得到具有新抗谱的抗稻瘟病基因，即为目的抗稻瘟病基因。步骤1)中，所述已知的抗稻瘟病基因为序列表中序列5所示；所述引物对中的一 条引物为序列表中序列3所示，另一条引物为序列表中序列4所示。步骤2)中，所述稻瘟病菌高抗水稻为多年生普通野生稻(Oryza rufipogon)，命 名为多年生普通野生稻(Oryza rufipogon) 38，其IRGC国际编号为100920 ；步骤4)中，所述易感稻瘟病水稻的品种为TP309。步骤1)中，所述引物对中的一条引物为序列表中序列3所示，另一条引物为序列 表中序列4所示；步骤4)中，所述抗谱测定的方法为将稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)接种 到转基因水稻中，得到接菌后转基因水稻，一周后观察，未出现病斑的转基因水稻中的抗稻 瘟病基因为目的抗稻瘟病基因；所述接种的方法为将稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)悬浮液注射到转入抗 稻瘟病基因的易感稻瘟病水稻的茎杆基部；所述接种的量为直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出；所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)悬浮液按照如下方法制备将稻瘟病 病原菌(Magnaporthe grisea)孢子用水稀释，得到稻癌病病原菌(Magnaporthe grisea) 悬浮液，所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)孢子在稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)悬浮液中的浓度为5 X IO4孢子/毫升；所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)的小种为如下至少一种ZB15、CH43、 Sichuan36、JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、Zhongl0-8-14、ZK-10-2、91-65-l、 97-3-1、97-27-2、99-20-2、99-26-1和 99-26-2。本发明的另一个目的是提供一种水稻抗稻瘟病蛋白及其编码基因。本发明提供的蛋白质，命名为Pid3_38，来源于普通野生稻(Oryza rufipogon) 38, 是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物抗稻瘟病相关的由1)衍生的蛋白质。上述序列2由924个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。所述编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物抗稻瘟病相关蛋白 质的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且编码所述与植物抗稻瘟病相关蛋白质的DNA分子。所述严格条件也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用 2XSSC,0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中的序列1，由2775个核苷酸 组成，编码区为序列1的自5’末端的第1-2775位核苷酸。含有所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明 保护的范围。所述重组表达载体为将所述的编码基因插入载体PZHOl的Xbal与Sail酶切 位点之间得到的重组表达载体。扩增所述的编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物 对如下所示一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所
7J\ ο本发明的第三个目的是提供一种培育抗稻瘟病转基因植物方法，。本发明提供的方法是将所述的编码基因导入目的植物，获得抗稻瘟病的转基因植 物。所述稻瘟病由下述稻瘟病的病原菌(Magnaporthe grisea)小种中的至少一种引 起Sichuan36、ZhonglO-8-14、ZK-10-2或97-27-2 ；所述目的植物为双子叶植物或者单子 叶植物，优选为单子叶植物。所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。所述蛋白质、所述的编码基因、所述的表达载体或所述的方法在筛选抗稻瘟病基 因中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明的技术方案能产生以下技术效果1.本发明利用已克隆的抗稻瘟病基因序列信息，直接分离其在野生稻或是高抗水 稻品种中的同源基因，直接转化易感稻瘟病水稻品种，，获得抗稻瘟病的水稻，对转基因植 株进行抗谱测定，筛选出具有新抗谱的抗稻瘟病基因，从而能快速的鉴定出可能具有更好 抗稻瘟病性的同源基因，克服了传统图位克隆的过程繁琐，费时费力等缺点。2.水稻中NBS-LRR类基因众多，可以大规模的利用已经克隆的基因序列信息来获 得其他同源基因，通过不同同源基因间的组合，有利于对水稻品种进行整体改良。
图1为PCR扩增Pid3_38基因电泳2为Pid3_38构建到表达载体上示意3为潮霉素和Pid3_38基因CAPS标记检测4为Pid3_38基因在水稻品种TP309中过表达植株以及对照植株的表达分析图5为Pid3_38基因在水稻品种TP309中过表达植株以及对照植株的表型
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、Pid3_38的获得1.设计引物抗稻瘟病基因Pdi3是从水稻品种地谷中克隆得到的，它对粳稻区稻瘟病菌小种 具有较好的抗性，其中用来定位克隆的鉴别小种为粳稻区稻瘟病菌小种zhong-10-8-14。从 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)上获得地谷中抗稻瘟病基因Pid3全基因序列，Pid3 基因全长2775bp (序列5)。设计引物如下d 3 F 5 ‘ _atggcggagggtgttgtgggctc_3 ‘ 禾口 d3R: 5 ‘ -ttattgaatcctttctgcagcc-3‘ 0为了便于后续试验将所扩增基因连入表达载体，特在上下游引物中分别加入含有 保护碱基的Xbal和Sail酶切位点，故所用来扩增引物为Pid3F 5' -TTTCTAGAatggcggagggtgttgtgggctc-3‘ (Xbal)(序列 3)；Pid3R 5' -CTGTCGACttattgaatcctttctgcagcc-3‘ (Sail)(序列 4);2、Pid3_38 的获得提取普通野生稻(Oryza rufipogon) 38 (唐小敏.，几个重复序列在稻属AA染 色体组稻种中的分布及其与稻种分化关系的研究.中国科学院遗传与发育生物学研究 所.2005，博士学位论文，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)叶片基因 组DNA作为模板，用引物Pid3F和Pid3R扩增，扩增反应混合物如下
ddH2015. 1 μ 110 X PCR缓冲液2. 5μ 1dNTP Mixture(2. 5mM)2. 5μ 1KOD 酶(5U/ μ 1)0. 2μ 1引物(IOmM)0. 25 μ 1引物(IOmM)0. 25 μ 1模板(DNA)1 μ 1MgS04(25mM)1. 6μ 1DMSO1. 6μ 1Total25 μ 1
PCR反应条件先94°C预变性4min ；然后94°C变性30S ；58°C退火30S ；68°C延伸 3min，共30个循环；最后68°C延伸5分钟。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约2800bp左右的条带 (图1)。切下该目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到peasy-TBlimt载体(购自全式金 公司)，转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，将转化子提取质粒，送去测序，结果为该质粒中含 有该PCR产物，该PCR产物具有序列表中的序列1，序列表中的序列1由2775个核苷酸组 成，该PCR产物的基因命名为Pid3-38，其编码区为序列表中序列1自5’末端第1-2775位 核苷酸，编码的蛋白命名为Pid3-38，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，序列2由 924个氨基酸残基组成。实施例2、转Pid3_38水稻及其功能研究一、转 Pid3-38 水稻将实施例1得到的PCR产物经过Xbal与Sail酶切，得到的片段与经过同样酶切 植物双元表达载体 PZHOl (Xiao, H.，Wang, Y.，Liu, D.，Wang, W. , Li, X. , Zhao, X.，Xu, J.， Zhai, W. and Zhu, L(2003)Functional analysis of the rice AP3 homologue 0sMADS16 by RNA interference. Plant Mol. Biol. 52，957-966.，公众可从中国科学院遗传与发育生 物学研究所获得。)的载体片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，将转化子 提取质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1的自5’末端第1-2775位核苷酸插 入到PZH01的Xbal与Sail酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为PZH01_38pid3，该质粒 即为重组表达载体，构建图谱如图2所示。将PZH01-38pid3转入农杆菌LBA4404中(Chen，X.，J. Shang，D. Chen,C. Lei, Y. Zou et al.,2006 A B-Iectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance. Plant J. 46:794-804.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)，得到转 化子，提取质粒送去测序，结果该质粒为PZH01-38pid3，将含有该质粒的转化子命名为 A-PZHOl-38pid3。将A-PZHO l-38pid3 转入品种为 TP309 的水稻(Junjun Shang.，et al. Identification of a New Rice Blast Resistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-Binding Site-Leucine-RichRepeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the Two Sequenced Rice Genomes. Genetics,2009 年， 182 :1303-1311,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，得到7个TO代转 Pid3-38水稻株系，编号为0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6、0E7。采用同样的方法将空载体 PZH01导入到品种为TP309的水稻中，得到8株转空载体水稻。提取叶片DNA进行PCR鉴 定，引物为Pid3F和Pid3R，结果为不含有目的基因Pid3_38。2、分子检测分别提取7个TO代转Pid3-38水稻株系(编号为OEl、0E2、0E3、0E4、 0E5、0E6、0E7)和转空载体水稻的DNA (CK)作为模板，利用CAPS标记引物Pid3JF 5' -TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC-3和Pid3JR -ACGTCACAAATCATTCGCTC-3‘进行扩增， 以野生型水稻(水稻品种TP309)为对照。结果为，野生型水稻(水稻品种TP309)和7个TO 代转Pid3-38水稻株系均得到约600bp大小的PCR产物。然后将各个扩增产物进行BamHl 酶切，电泳检测。
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同时以 7 个 TO 代转 Pid3-38 水稻株系(编号为 0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6、0E7) 和转空载体水稻的DNA (CK)为模板，所用引物为HYGF 5 ‘ -GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-3 和HYGR:5' -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3‘，检测潮霉素抗性基因(HYG)转入情况。电 泳检测。以野生型水稻(水稻品种TP309)为对照。结果如图3所示，可以看出，与野生型水稻(TP309)和转空载体水稻(CK)比较，经 过BamHl酶切电泳检测后，7个TO代转Pid3_38水稻株系(编号为0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、 0E6、0E7)均得到的2条带的CAPS标记的片段(序列表1的第2204-2209位为BamHl酶切 位点)，说明7个TO代转Pid3-38水稻株系均为阳性TO代转Pid3-38水稻株系。而HYG基 因(HYG基因存在在载体PZHOl上)在野生型水稻中没有，HYG基因在7个TO代转Pid3_38 水稻株系和转空载体水稻中均有，进一步说明7个TO代转Pid3-38水稻株系均为阳性TO 代转Pid3-38水稻株系。3、基因过表达分析以7个TO代转Pid3_38水稻株系、野生型水稻(TP309)和转空载体水稻 (CK)为实验材料，提取其叶片总RNA，利用OligdT将其反转录为CDNA。以此cDNA为 模板，用引物Pid3JF和Pid3JR扩增，同时以Actin为检测内参，所用引物为ActinF 5' -AGCAACTGGGATGATATGGA-3‘和 ActinR :5' -CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3‘。结果如图4所示，与转空载体水稻和野生型水稻相比，7个转基因株系得到PCR产 物量大，由于载体PZHOl上有过表达启动子35S，因此进一步证明7个转基因株系均为阳性 株系。二、转Pid3_38水稻功能研究禾g ■ _ 的 _ 帛胃(Magnaporthe grisea) /]、禾中 ZB15、 CH43、 Sichuan36> JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、ZhonglO-8-14、ΖΚ-10-2、91-65-1、97-27_2、 99-20-2,99-26-1和99_26_2均记载在，尚俊军，水稻NBS-LRR基因家族分析与抗稻瘟病因 基因Pid3的克隆，中国科学院遗传与发育生物学研究所.2007，博士学位论文中，以上小种 公众均可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。1、初步鉴定在大田中，将转空载体水稻、水稻品种TP309 (野生型水稻)和7个TO代转Pid3_38 水稻株系(编号分别为OEl、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6、0E7)的植株均移栽后一个月左右未 孕穗前利用注射器分别进行注射接菌，具体为用无菌水将稻瘟病的病原菌(Magnaporthe grisea)小种zhong-10-8-14配置成5 X IO4孢子/毫升的孢子悬浮液，用普通医用注射器 从水稻茎杆基部将Iml孢子悬浮液注入直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出。转空载体水稻和 野生型水稻(TP309)各为3株，实验重复三次。一周后调查发病情况，观察植株，无病斑的为抗稻瘟病(R)，有褐点病斑的为感稻 瘟病(S)。结果如图5所示，发现，7个TO代转Pid3_38水稻株系(编号分别为0E1、0E2、 0E3、0E4、0E5、0E6、0E7)均无任何病斑出现，说明7个TO代转Pid3_38水稻株系抗稻瘟病 菌Magnaporthe grisea小种zhong-10-8-14。而3株转空载体水稻(CK)和3株野生型水稻 (TP309)均有褐点病斑出现，说明不抗稻瘟病菌Magnaporthe grisea小种zhong-10-8-14。2、感病鉴定
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收获TO代转Pid3_38水稻株系(编号分别为0E1)的种子，播种后得到Tl代转 Pid3-38水稻株系0E1。将Tl代转Pid3_38水稻株系OEl提取DNA，进行分子检测，引物为 Pid3JF和Pid3JR，得到的PCR产物再BamHl酶切，得到两条带的为阳性，得到53株阳性Tl 代转Pid3-38水稻0E1。分另Ij Mf 稻癌病的病原菌 Magnaporthe grisea 小种 ZB15、CH43、Sichuan36、 JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、ZhonglO-8-14、ΖΚ-10-2、91-65-1、97-27_2、 99-20-2,99-26-1和99_26_2接种到Tl代转Pid3_38水稻OEl进行稻瘟病抗谱测定，具体 接种方法如下分别用无菌水将不同小种配置5X IO4孢子/毫升的孢子悬浮液，用普通医 用注射器从水稻茎杆基部将Iml孢子悬浮液注入直至悬浮液从水稻茎杆顶部溢出，每个菌 接三株，每株接三个分蘖。以TP309水稻(野生型)、转空载体的转基因水稻和纯合的转地谷Pid3转基因水 禾苗(Junjun Shang.，et al. Identification of a New Rice Blast Resistance Gene，Pid3， by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-Binding Site-Leucine-RichRepeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the Two Sequenced Rice Genomes. Genetics，2009年，182 :1303_1311，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得) 为对照。接种每个菌株的以上各株系各取3株进行实验，实验重复三次。观察无病斑的为抗稻瘟病(R)，有褐点病斑的为感稻瘟病(S)，结果如表1所示，转 地谷中pid3转基因水稻(转Pid3水稻)和Tl代转Pid3-38水稻OEl (转Pid3_38水稻 (OEl))对稻瘟病菌的抗谱存在差异。
表1转Pid3-38水稻(OEl)对稻瘟病菌抗谱存在差异
菌株ΤΡ309转空载转Pid3水稻 转Pid3_
ZB15SSSS
CH43SSRS
Sichuan36SSRR
JS2001-108SSRS
Sichuan26SSSS
CH706SSRS
CH45SSSS
CH704SSS5
ZhonglO-8-14SSRR
ZK-10-2SSRR
91-65-1SSSS
97-27-2SSSR
99-20-2SSRS
99-26-1SSSS
99-26-2SSRS
野生型水稻(ΤΡ309)与转空载体水稻结果无显著差异。
从表1中看出，野生型水稻(ΤΡ309)和转Pid3-38水稻(OEl)
与野生型水稻(TP309)相比，转 Pid3_38 水稻(OEl)对 Sichuan36、ZhonglO-8_14、 ZK-10-2,97-27-2有抗性；而转Pid3水稻对97_27_2没有抗性，说明转Pid3_38水稻(OEl) 在抗97-27-2菌方面，优于转Pid3水稻。
权利要求
一种克隆抗稻瘟病基因的方法，包括如下步骤1)根据已知的抗稻瘟病基因设计引物，得到引物对；2)以对稻瘟病菌高抗水稻基因组DNA为模板，用步骤1)得到的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；3)将步骤2)得到的PCR扩增产物进行测序，得到抗稻瘟病基因；4)将步骤3)得到抗稻瘟病基因转入易感稻瘟病水稻，得到转基因水稻，对转基因水稻进行稻瘟病的抗谱测定，得到具有新抗谱的抗稻瘟病基因，即为目的抗稻瘟病基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述已知的抗稻瘟病基因为序列表中序列5所示；步骤2)中，所述稻瘟病菌高抗水稻为普通野生稻(Oryza rufipogon)；步骤4)中，所述易感稻瘟病水稻的品种为TP309。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述引物对中的一条引物为序列表中序列3所示，另一条引物为序列表中 序列4所示；步骤4)中，所述抗谱测定的方法为将稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)接种到转 基因水稻中，得到接菌后转基因水稻，一周后观察，未出现病斑的转基因水稻中的抗稻瘟病 基因为目的抗稻瘟病基因。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)的小种为如下至少一种ZB15、CH43、 Sichuan36、JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、Zhongl0-8-14、ZK-10-2、91-65-l、 97-3-1、97-27-2、99-20-2、99-26-1和 99-26-2。
5.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物抗稻瘟病相关的由1)衍生的蛋白质。
6.权利要求5所述蛋白质的编码基因。
7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)或2)或3) 所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物抗稻瘟病相关蛋白质的 DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且编码所述与植物抗稻瘟病相关蛋白质的DNA分子。
8.含有权利要求6或7所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达 盒；所述重组表达载体具体为将权利要求6或7所述的编码基因插入载体PZHOl的多克隆 位点得到的重组表达载体。
9.一种培育抗稻瘟病转基因植物方法，为将权利要求6或7所述的编码基因导入目的 植物，获得抗稻瘟病的转基因植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述稻瘟病由下述稻瘟病的病原菌 (Magnaporthe grisea) /]、禾中中的—禾中弓I fe :Sichuan36> Zhongl0_8_14、 ZK-10-2 97-27-2 ；所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为单子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种克隆抗稻瘟病基因的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)根据已知的抗稻瘟病基因设计引物，得到引物对；2)以对稻瘟病菌高抗水稻为模板，用步骤1)得到的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；3)将步骤2)得到的PCR扩增产物进行测序，得到抗稻瘟病基因；4)将抗稻瘟病基因转入易感稻瘟病水稻，进行稻瘟病的抗谱测定，得到具有新抗谱的抗稻瘟病基因，即为目的抗稻瘟病基因。本发明的实验证明，本发明直接分离野生稻中的抗稻瘟病基因，转化水稻品种，获得抗稻瘟病的水稻，对转基因植株进行抗谱测定，筛选出具有新抗谱的抗稻瘟病基因，有利于对水稻品种进行整体改良。
文档编号C12N15/10GK101979543SQ20101052926
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者吕启明, 朱立煌, 李仕贵, 李晓兵, 江光怀 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所