bi .nlm.nih. gov)数据库捜索已测定 的部分无脊椎动物线粒体基因组的ND2、C0I、C0II、C0III、ND5、ND4、巧tB、16S和12S基因序 列，将序列载入BioEdit软件，利用Clus化1W算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列， 将捜寻到的保守序列载入Oligo 6软件，手动调试设计出所述无脊椎动物线粒体基因组扩 增引物(参见表2)。获得设计引物后可利用Premier Primer 5.0软件考察引物间形成同源 或异源二聚体的可能性并排除形成同源或异源二聚体的可能性大的那些。引物3'端两个碱 基为硫代修饰，W防止化i29 DNA聚合酶对引物3 '端进行3 ' -5 '外切酶活性切割。
[0083] 由苏州金唯智公司根据发明人的要求合成具有表2所示核巧酸序列的通用引物， 纯化方式为HPLC。
[0084] 实施例2酪氯仿法抽提动物总DNA
[0085] 取剪碎的新鲜动物组织lOOmg(如为微小动物，则保留必要残体后全部使用），经液 氮研磨后，使用100μΙ的TE缓冲液（lOmM Tris-肥l，lmM邸TA，pH=8.0)重悬，加入化L 10% SDS，0.祉L 25mg/ml 化ase AayL lOmg/ml ProK后，50°C解育60分钟。后加入55yL苯酪，55 化氯仿:异戊醇(24:1)，混匀后12000g离屯、6分钟，保留上清。再加入10化L氯仿:异戊醇(24: 1)，混匀后12000g离屯、6分钟，保留上清。W上溶液，加入27化L无水乙醇，-80°C保存20分钟 后，12000g离屯、20分钟，保留沉淀。加入预冷的500μΙ 70%乙醇，-80°(3保存10分钟后， 12000g离屯、20分钟，保留沉淀。50°C溫育沉淀2分钟，使乙醇挥发干净后，使用30化ΤΕ缓冲 液重悬，得到总DNA提取液。
[0086] 本实施例新鲜动物组织分别来源于家衣鱼、广斧瞳卿、勇斧瞳卿、丽拟丝鹏、樓桃 蜂卿、马达加斯加蜂卿、金边地整、杜比亚蜂卿、中华真地整、麻皮睹、细纹小家蚁、琵琶甲、 挪屯、叶甲、竹虫、黄粉虫、洋虫、康瘦蚊、挪子织蛾、球鼠妇、雷达蜗、毛蝴、泥蝴、青始、兰始、 通俗腔蝴、菲牛赔、雨蛙、大泛树蛙、中国林蛙、乌梢蛇、小鼠。
[0087] 实施例3线粒体基因组的扩增
[008引分别精密量取化L应用实施例2的方法得到的动物总DNA(10-l(K)ng)，加入化L样品 缓冲液，94°C加热3分钟，后缓慢冷却至室溫。此后加入14化反应缓冲液，0.5化PM29 DNA 聚合酶(储液浓度为lOU/化），0.扣L焦憐酸酶(Pyrophosphatase)(储液浓度为0.0411/化）， 30°C下解育12至18小时，然后65°C解育10分钟使反应终止。获得富集的12种动物线粒体基 因组。其中，样品缓冲液的组成:50yL引物混合物(0.5化的100μΜ引物，共18条引物，W及41μ L的d地20)，12化L的2Χ 退火缓冲液（80mM Tris-HCl pH 7.6,20mM MgCl2)，W及25化的 d地20,共计20化L，每离屯、管分装50化并于-20°C保存。反应缓冲液的组成：100化的PM29 10 X buff er，加入40化的lOmM dNTPs，560化的d地20，共计700yL，每离屯、管分装lOOyL并于-20°C保存。图1为应用本实施例方法获得的12种动物的含有富集的线粒体基因组的总DNA的 琼脂糖凝胶电泳图。
[0089] 将应用实施例3的方法得到的含有富集的线粒体基因组的总DNA应用于二代测序 (Ion Torrent PGM，318cMp)及Ξ代测序(PacBio RS 11，1 SMRT cell),从可匹配到线粒 体基因组的有效reads比例来看，本发明可将线粒体DNA占总基因组DNA的质量比例从约1 % 提升至80%左右。再将测序结果进行拼接，其中所获得的15种动物的线粒体基因组的结构 示意图详见图2-16。表3列出了 15种线粒体基因组对应的序列编号。
[0090] 表 3
[0091]
[0092]
[0093] W上对本发明所提供的用于动物线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计 和扩增方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了 阐述，W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
【主权项】
1. 一种用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其包含具有W下序列的通用引 物或其化学修饰衍生物：其中所述动物为除刺胞动物W外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，W及蛙、蛇 或鼠。2. 如权利要求1所述的用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，所述通用引物 3 '端的两个碱基进行硫代修饰。3. 如权利要求1所述的用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其中所述动物 选自：扁形动物、线形动物、星虫动物、环节动物、软体动物、节肢动物、苔薛动物、腕足动物、 棘皮动物W及蛙、蛇或鼠。4. 如权利要求1或3所述的用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其中所述动 物选自：家衣鱼、广斧瞳卿、勇斧瞳卿、丽拟丝鹏、樓桃蜂卿、马达加斯加蜂卿、金边地整、杜 比亚蜂卿、中华真地整、麻皮睹、细纹小家蚁、琵琶甲、挪屯、叶甲、竹虫、黄粉虫、洋虫、康瘦 蚊、挪子织蛾、球鼠妇、雷达蜗、毛蝴、泥蝴、青始、兰始、通俗腔蝴、菲牛赔、雨蛙、大泛树蛙、 中国林蛙、乌梢蛇或小鼠。5. 如权利要求1所述的通用引物的设计方法，其特征在于，登录NCBI网站中的GenBank 数据库捜索已测定的编号为U37541.1、NC_002084.1、NC_002355. UKP163643.1、NC_ 003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_002651.1、NC_004371.1、NC_006895.1、NC_ 005437.1、 NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_ 002184.1、 NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、NC_023836.1和NC_006665的部分无脊椎 动物线粒体基因组序列，进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将捜寻到的保守序列载 入引物设计软件，设计出所述用于动物线粒体基因组扩增的通用引物。6. -种利用如权利要求1所述的通用引物混合物进行动物线粒体基因组扩增的方法， 其特征在于，扩增体系包括样品体系和反应体系， 其中每扣1样品体系包含： 动物总 DNA 10-100 ng， 引物絕合物 （0.0005-0.01)叫敞IX 18， 2 X退火缓冲液 2-3叫， 双蒸水 0 I-Iu!; 每15山反应体系包含： Bi投9 酶： 1U-10U， 焦縣酸酶 0.01U-0 05U，： dNTP 0.005-0.01 Limol, IOX抓垃9缓冲液 1-5以1， 双蒸水 8-13此 扩增条件为： 变性 90-96 °C，1-5分钟， 退火 缓慢冷却至室温， 延伸 巧-35°C, 12-18小时， 终止 65°C，5-15分钟。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于， 其中每扣1样品体系包含： 动物总技NA 10-100 ng, 引物源合物 化005阳HOl X 18， 2X化火缓冲娘 2 5 pi, 双蒸水 0,5曲 每15山反应体系包含： Phi29 酶 5 U， 焦憐酸酶 化似U， CiNTP 0.0(化拜 〇1， 10XPhi29缓冲液 2川， 双蒸水 11 2 Lil; 扩增条件为： 变性 90-96°C, 1-5分钟， 退火 缓慢冷却至室温， 延伸 25-%°C，12-18:小姑， 终止 65 C 10分钟。8. 如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述退火缓冲液是pH为7.6,化is-HCl终 浓度为SOmM MgCl2终浓度为20mM的混合溶液。9. 一种用于扩增动物线粒体基因组的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的通 用引物混合物，其中所述动物为除刺胞动物W外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物， W及蛙、蛇或鼠。10. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括退火缓冲液、双蒸水、PM29酶、焦 憐酸酶、dNTP、化i 29缓冲液，及操作说明书。
【专利摘要】本发明实施例公开了一种用于动物线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法，以及包含所述通用引物混合物的试剂盒。利用本发明的提供引物混合物或试剂盒和提供的动物线粒体基因组扩增方法，结合新兴的高通量测序技术，可以高效低成本地获得动物线粒体基因组信息。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506103
【申请号】CN201511016636
【发明人】田晓轩, 崔英, 董鹏志, 朱彦, 高秀梅, 刘杰
【申请人】天津中医药大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月28日