污染，而富集扩增产物一般在10KW上，可结合长读长的Ξ 代测序技术(PacBio RS II等），跨越高重复性的线粒体控制区。且由于无脊椎动物线粒体 基因组较小(通常小于20肺），经本技术处理后，很小的测序通量即可实现线粒体基因组的 深度覆盖，拼接计算复杂度低，计算机时成本大幅下降。
【附图说明】
[0047] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W 根据运些附图获得其他的附图。
[0048] 图1为应用本方法富集扩增线粒体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0049] 其中M:DNA分子量标准a-EcoT14 I山旨日31，了日1?1脚），1-12:依次为：家衣鱼、广斧 瞳卿、丽拟丝鹏、金边地整、麻皮睹、挪屯、叶甲、挪子织蛾、雷达蜗、青始、通俗腔蝴、雨蛙、乌 梢蛇。13号为负对照。
[(K)加]图2为杜比亚蜂卿Blaptica dubia的线粒体基因组结构示意图；
[0化1] 图3为金边地整化isthoplatia orientalis的线粒体基因组结构示意图；
[0化2] 图4为台湾宽斧瞳卿化erodula formosana的线粒体基因组结构示意图；
[0化3]图5为麻皮睹化thesina fullo的线粒体基因组结构示意图；
[0化4] 图6为挪子织蛾化isina arenosella的线粒体基因组结构示意图；
[0化5] 图7为康瘦蚊Contarinia maculipennis的线粒体基因组结构示意图；
[0化6]图8为黄粉虫化nebrio molitor的线粒体基因组结构示意图；
[0057] 图9为雷达蜗Typopeltis crucifer的线粒体基因组结构示意图；
[0化引图10为金头娱蚁Scolopemlra subspinipes的线粒体基因组结构示意图；
[0化9] 图11为通俗腔蝴Me化地ire vulgaris的线粒体基因组结构示意图；
[0060] 图12为泥蝴化gillarca granosa的线粒体基因组结构示意图；
[0061 ] 图13为青始Cyclina sinensis的线粒体基因组结构示意图；
[0062] 图14为雨蛙Hyla tsinlingensis的线粒体基因组结构示意图；
[0063] 图15为大泛树蛙化acophorus dennysi的线粒体基因组结构示意图；
[0064] 图16为乌梢蛇Ptyas化皿nades的线粒体基因组结构示意图。
【具体实施方式】
[0065] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0066] 本发明的技术方案公开了一种用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物。
[0067] 本发明的技术方案还公开了所述通用引物的设计方法，具体为:登录NCBI网站中 的GenBank化ttp://ww.ncbi .nlm.nih.gov)数据库捜索已测定的编号为U37541.1、NC_ 002084.1、 NC_002355.1、ΚΡ163643.1、NC_003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_ 002651.1、 NC_004371.1、NC_006895.1、NC_005437.1、NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、 X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_002184.1、NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、 NC_023836.1和NC_006665的部分无脊椎动物线粒体基因组序列（如表1所示），将其载入 BioEdit软件，利用ClustalW算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将捜寻到的保 守序列载入Oligo软件，手动调试设计出用于动物线粒体基因组扩增的通用引物。获得设计 引物后可利用Premier Primer软件考察引物间形成同源或异源二聚体的可能性并排除形 成同源或异源二聚体的可能性大的那些。
[0068] 表1部分无脊椎动物线粒体基因组
[0069]
[0070] 利用本发明的引物结合Phi29 DM聚合酶扩增方法，可将线粒体DM占总基因组 DNA的比例从约为1%提升至80%左右，结合后续高通量测序方法可获得线粒体基因组完整 序列。体现出该扩增方法的适用范围广，可为获取正确的动物线粒体基因组序列W进行种 类鉴定、种质资源调查W及物种多样性研究提供一个有力保障。并且，PM29 DNA聚合酶能 够高效合成DNA，每一次结合到DNA链上可W引导至多70,000碱基的渗入。该酶还具有3'-5' 核酸外切酶高保真纠错功能，错误率仅为5 Xl〇-6,大约比化q DNA聚合酶低100倍。运一恒溫 扩增方法可W从纳克量级起始DNA模板得到微克量级DNA产物。
[0071] 需要说明的是，单位ml表示为表示为ymol/L。引物是由生物公司合成成 品，为了减少化i29 DNA聚合酶对引物3'端进行3'-5'外切酶活性切割，引物3'端的两个碱 基可W进行硫代修饰(如表2所示）。
[0072] 表2通用引物列表
[0073]
[0074] 需要进一步说明的是，在进行DNA扩增前，优选对使用的设备和试剂，如微量移液 器，PCR管，双蒸水等进行灭菌。灭菌可选用紫外灭菌30分钟左右或高压湿热灭菌20分钟左 右，具体的灭菌方式，本领域技术人员可根据实际经验自行把握，本发明在此不作寶述。本 发明所述的解育可W为恒溫水浴也可W在PCR仪上保溫，此为本领域常用的技术手段，本发 明不作具体限定。本发明的技术方案对水的要求很高，通常纯水是指水电阻率为18.2ΜΩ* cm的水，一般双蒸水(dd出0)即可达到此标准。
[0075] 需要说明的是，本发明所使用的化i29 DNA聚合酶、10X化i29 DNA聚合酶buffer、 焦憐酸酶和dNTP皆市售可得，本领域技术人员可根据产品的使用说明书配制和使用。本发 明所说的动物总DNA和通用引物混合物可为将动物总DNA或通用引物混合物溶解在双蒸水 或 1 X TE缓冲液（1 OmMTriS-HC1，ImM EDTA，pH=8.0)中。
[0076] 由于除少数刺胞动物W外的绝大部分无脊椎动物的线粒体基因组皆为闭合环状 双链DNA，并且其线粒体基因组的脱氧核巧酸数量一般在14~20化之间，因此，本发明的技 术方案更适用于除部分刺胞动物W外的大多数无脊椎动物线粒体基因组扩增。
[0077] 需要说明的是，本发明所说的无脊椎动物是指背侧没有脊柱的动物，所说的刺胞 动物，也叫腔肠动物，属于刺胞动物口或腔肠动物口，包括珊瑚、水嘘·、海蜜（jel lyf ish)、僧 帽水母（Portuguese man-of-war)和海葵（sea anemone)等。
[0078] 本发明技术方案中，动物线粒体基因组扩增方法优选适用的实施例动物为杜比亚 蜂卿Blaptica dubia(董赚目，昆虫纲，无脊椎动物）、金边地整Opisthoplatia orientalis (董赚目，昆虫纲，无脊椎动物）、台湾宽斧瞳卿化erodula formosana(瞳卿目，昆虫纲，无脊 椎动物）、麻皮睹Erthesina fullo(半翅目，昆虫纲，无脊椎动物）、挪子织蛾Opisina arenosella(鱗翅目，昆虫纲，无脊椎动物）、康瘦蚊Contarinia maculipennis(双翅目，昆 虫纲，无脊椎动物）、黄粉虫Tenebrio molitor(銷翅目，昆虫纲，无脊椎动物）、雷达蜗 Typopeltis crucifer(蜗目，蛛形纲，无脊椎动物）、金头娱蚁Scolopen化a subspinipes (娱蚁目，唇足纲，无脊椎动物）、通俗腔蝴Meta地ire vulga;ris(寡毛纲，环节动物，无脊椎 动物）、泥蝴Tegi 1 larca granosa(列齿目，双壳纲，软体动物，无脊椎动物）、青始切clina sinensis(帘始目，双壳纲，软体动物，无脊椎动物）、雨蛙Hyla tsinlingensis(无尾目，两 栖纲，脊椎动物）、大泛树蛙Rhacophorus dennysi(无尾目，两栖纲，脊椎动物）、乌梢蛇 Ptyas化umnades(蛇亚目，爬行纲，脊椎动物）等。
[0079] 本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部 分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
[0080] 实施例所用到的试剂均市售可得。
[0081] 实施例1通用引物的设计
[0082] 登录NCBI网站中的GenBank化t1:p://www.nc