如下：
[0054] 1. 1. 1构建含野生型Cas9的质粒：
[0055] 通过两步PCR的方法将hSpCas9n nickase结构域RuvC-like I中的丙氨酸（A) 突变为天冬氨酸（D)，进而得到可以同时切割DNA双链的野生型Cas9。
[0056] 具体步骤如下：1)以pX335质粒为模板，分别用Fl/Rl、F2/R2引物对进行PCR扩 增，得产物A、B ;2)对A、B进行胶回收，并以此为混合模板用F1/R2引物对进行第二次PCR 扩增，得产物C ;3)对纯化后的产物C及pX335质粒，做Agel/BgLII双酶切，分别以此为插 入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到含有野生型 Cas9 的质粒，即 CBh-HA-NLS-hSpCas9-NLS-bGH polyA。
[0057] 相关引物序列具见表2:
[0058]
[0059] 1. 1. 2去除Cas9 C端的核定位信号（NLS):
[0060] 通过一步PCR扩增的方法去除Cas9 C端的核定位信号，得到如下Cas9蛋白表达 模块结构：CBh-HA-NLS-hSpCas9-bGH polyA。
[0061] 具体步骤如下：1)以上述含野生型Cas9的质粒为模板，用F3/R3进行PCR扩增 (R3带有EcoRI酶切位点，如表3横线部分所示）；2)PCR产物纯化；3)对纯化后的PCR产 物及含野生型Cas9的质粒，做BsmI/EcoRI双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连接、 转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到质粒中Cas9蛋白表达模块结构如下： CBh-HA-NLS-hSpCas9-bGH polyA。
[0062] 相关引物序列具见表3:
[0063]
[0064] 1· 1· 3去除Cas9 N端核定位信号（NLS)的同时引入MTS-Flag或MTS-NES-Flag结 构：
[0065] 通过两步PCR扩增的方法去除Cas9 N端NLS的同时引入 MTS-Flag或MTS-NES-Flag结构，得到如下两种Cas9蛋白表达模块结构： CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGHpolyA 和 CBh-MTS-NES-Flag-hSpCas9-bGH polyA，即为 mtCas9 蛋白的两种表达模块结构。
[0066] 首先，含 CBh-MTS-Flag-hSpCas9_bGH polyA 结构的质粒构建：
[0067] 具体步骤如下：1)以本实验室已构建成功，含有MTS的质粒为模板，用F4/R4引物 对进行PCR扩增（F4带有Agel酶切位点，R4的5'端带有Flag标签，如表4横线部分所 示），得产物D ;2)同时以上述步骤1. 1. 2中构建的质粒为模板，用F5/R2引物对进行PCR 扩增（F5的5'端带有Flag标签，如表4横线部分所示），得产物E ;3)对D、E进行胶回收， 并以此为混合模板用F4/R2引物对进行第二次PCR扩增，得产物F ;4)对纯化后的产物F及 上述步骤1. 1. 2中构建的质粒，做Agel/Bglll双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连 接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到质粒中的Cas9蛋白表达模块结构 如下：CBh-MTS-Flag-hSpCas9_bGH polyA，B卩为第一种mtCas9蛋白表达模块结构。
[0068] 相关引物序列具见表4:
[0069]
[0070」 冋埋，：
po_LyA 铕构的Μ祖构建：
[0071] 具体步骤如下：1)以本实验室已构建成功，含有MTS-NES的质粒为模板，用F4/R6 引物对进行PCR扩增（F4带有Agel酶切位点，R6的5'端带有Flag标签，如表4横线部分 所示），得产物G ;2)同时以上述步骤1. 1. 2中构建的质粒为模板，用F5/R2引物对进行PCR 扩增（F5的5'端带有Flag标签，如表4横线部分所示），得产物Η ;3)对G、H进行胶回收， 并以此为混合模板用F4/R2引物对进行第二次PCR扩增，得产物I ;4)对纯化后的产物I及 上述步骤1. 1. 2中构建的质粒，做Agel/BgLII双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连 接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到质粒中的Cas9蛋白表达模块结构 如下：CBh-MTS-NES-Flag-hSpCas9_bGH polyA，B卩为第二种mtCas9蛋白表达模块结构。将 此质粒命名为mtCRISPR/Cas9。后续实施例所用mtCRISPR/Cas9系统中的mtCas9表达模块 均为此结构。
[0072] 相关引物序列具见表5:
[0073]
[0074] 1. 2mt_gRNA 的构建：
[0075] 本发明中进入线粒体的向导RNA包括以下两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶 向目标序列（Target sequence)和gRNA骨架（gRNA scaffold)序列三部分组成的RNA (如 图2A所示）；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列（22种）或 其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列四部分组成的RNA(如图2B、2C所示）。 其中，本实施例所用的RNA线粒体定位引导序列为RP(RNase，RP)序列。
[0076] 1. 2. 1 第一种 mt-gRNA 的构建：
[0077] 所述编码第一种mt-gRNA的DNA序列中编码RP序列、靶向目标序列的DNA片段， 可通过两条同时含有RP序列和靶向目标序列的互补寡核苷酸链经退火后，由Bbsl限制性 酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中。
[0078] 相关引物序列具见表6:
[0079]
[0080] 注：CACC、CAAA为连入载体所需粘性末端；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷 酸序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
[0081] 具体步骤如下：l)F-〇ligo/R-〇ligo引物对退火，95°C、5分钟；2)限制性内切酶 Bbsl酶切mtCRISPR/Cas9质粒，2小时后胶回收；3)以胶回收片段为载体、退火引物为插入 片段进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。
[0082] 最终，构建完成了第一种同时带有RP序列、靶向目标序列，作用于线粒体基因组 的 mtCRISPR/Cas9 系统。
[0083] 1. 2. 2 第二种 mt-gRNA 的构建：
[0084] 所述编码第二种mt-gRNA的DNA序列中编码RP序列、线粒体中任意一种tRNA (22 种）序列、靶向目标序列的DNA片段，可通过一对含RP序列的正向引物和含靶向目标序列 的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由Bbsl限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA 片段中。
[0085] 以线粒体编码的tRNA-Leul为例，相关引物序列具见表7 :
[0086]
[0087] 注：横线部分为Bbsl限制性酶切位点；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸 序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
[0088] 具体步骤如下：1)以HEK293细胞的基因组为模板，用F-Leul/R-Leul引物对做 PCR扩增；2) PCR产物纯化；3)对纯化后的PCR产物及mtCRISPR/Cas9质粒，分别做Bbsl单 酶切，分别以胶回收的酶切产物为插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正 确样品测序。
[0089] 最终，构建完成了第二种同时带有RP序列、tRNA-Leul序列、靶向目标序列，作用 于线粒体基因组的mtCRISPR/Cas9系统。
[0090] 实施例2
[0091] 一种新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统中mtCas9蛋白与线粒体 共定位。
[0092] 2. 1免疫荧光实验分析mtCas9蛋白与线粒体的共定位：
[0093] 具体步骤如下：
[0094] 细胞间内操作：1)将盖玻片放入六孔板中，植入适当密度的HEK293细胞。次日分 别瞬时转染含两种蛋白表达模块，即：CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGHpolyA和CBh-MTS-NES-F lag-hSpCas9-bGHpolyA的质粒，分别命名为MTS-Cas9、MTS-NES-Cas9 ;2)细胞培养至合适 时间后，取出细胞，PBS洗涤细胞两次，再加入提前用培养基稀释混匀的线粒体特异性染料 Mito Tracker，静置 20 分钟。
[0095] 细胞间外操作：1)细胞固定：取出细胞，PBS洗涤细胞两次，细胞片自然晾干，加入 lml以冰预冷4%多聚甲醛固定15分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；2)细胞透化：加入lml 含0. 2% TritonX-100的PBS透化处理10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；3)封闭：加 lml 含5%脱脂奶粉的PBS室温孵育30分钟；4) 一抗孵育：将Parafilm膜放在湿盒内，取出盖玻 片放在Parafilm膜上，加100 μ 1含5%脱脂奶粉的PBS稀释的一抗到盖玻片上，4°C孵育过 夜，PBS漂洗3次，每次5分钟；5)二抗孵育：加100ul含5%脱脂奶粉的PBS稀释的二抗到 盖玻片上，室温避光孵育1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟；6) DAPI染核：加 DAPI溶液染细 胞核，室温避光孵育2分钟；7)加去离子水漂洗去盐2次，每次5分钟。8)封片：取10ul封 片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。9)用Leica TCS SP5共聚焦荧光显微镜对蛋白定位进行检测。
[0096] 经免疫突光实验证明两种蛋白表达模块均可使mtCas9蛋白与线粒体共定位，结 果如图4A所示。
[0097] 2. 2线粒体分离验证mtCas9蛋白与线粒体的共定位：
[0098] 瞬时转染含两种蛋白表达模块，g卩：CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGHpolyA和CBh-MTS -NES-Flag-hSpCas9-bGHpolyA，分别命名为 MTS-Cas9、MTS-NES-Cas9 的质粒于 HEK293 细胞 中，24小时后收细胞，差速离心分离细胞核（Nu)、细胞质（Cyto)、线粒体（Mito)，并保存各 组分。利用蛋白免疫印迹（Western Blot)法，进一步验证mtCas9蛋