一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于末端延伸、金纳米粒子和氧化还原酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法。首先在金电极表面修饰一层巯基修饰的捕获探针分子用于捕获目标DNA分子，目标DNA分子被捕获探针捕获之后，信号探针修饰的金纳米粒子与目标DNA分子的另一端碱基互补配对修饰到电极表面，然后在末端延伸酶的催化作用下将生物素标记的脱氧核糖核苷酸延伸到信号探针的3’端，延伸过程中引入的生物素与亲和素标记的辣根过氧化物酶特异性结合，辣根过氧化物酶被修饰到电极表面，通过检测辣根过氧化物酶催化电解液产生的电化学信号的变化来实现对目标DNA分子的高灵敏度、高特异性检测，可用于分子识别、临床诊断、环境监测及食品安全等领域中DNA样品的检测。
【专利说明】
一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法
技术领域
[0001]本发明属于电化学生物传感器研究领域，涉及一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶催三级放大电化学传感器检测DNA的方法。
【背景技术】
[0002]DNA检测在分子识别、临床诊断、环境监测、食品安全等方面得到了广泛应用。而实际样本中所需要检测的DNA的浓度往往很低，设计和研究具有高灵敏度和选择性的传感器就成为了研究的重点。为了提高DNA检测的灵敏度，各种信号放大策略也应运而生，其中包括核酸扩增信号放大策略，纳米材料信号放大策略和酶催化信号放大策略等。
[0003]目前常用的核酸扩增技术了有聚合酶链式反应、滚环复制扩增和一些其他的等温核酸扩增技术。但是聚合酶链式反应技术需要严格控制温度的变化，而且需要比价复杂的反应仪器，成本较高；而滚环复制扩增过程也需要加入反应模版，从而增加了反应体系的复杂程度，也提高了成本。为了避免这些问题，一种新的核酸扩增技术表面诱导末端延伸技术应运而生，这种在末端延伸酶的催化作用下无需模版在核酸链的3’端延伸核酸长链的放大技术得到了广泛的应用。纳米材料因为其特有的尺寸性质，在信号放大策略中得到广泛应用。金纳米粒子有高的表面体积比、制备工艺较成熟、稳定性好、生物相容性好，易于功能化(特别是可以通过金-硫键将DNA修饰在金纳米粒子表面)等优点，在DNA的检测中作为信号放大材料得到广泛应用。酶的催化作用能够在引入一个酶分子的情况下催化多个底物的反应而使信号得到放大，也在信号放大策略中扮演着不可忽视的角色。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了尚灵敏和尚选择性地检测痕量的DNA片段，包括完全互补、单个碱基错配、两个碱基错配、三个碱基错配、完全非互补序列和血清样本中的DNA片段，提供一种基于末端延伸放大、金纳米粒子和酶催化三级放大电化学传感器检测DNA的方法。
[0005]实现本发明目的的技术解决方案为:一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，包括如下步骤:
[0006]步骤一、Au-DNA溶液的制备:在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’端被标记的巯基标记信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；
[0007]步骤二、电化学传感器的制备:(a)金电极的清洗:以NaBH4S液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面:室温下在金电极表面自组装3’端标记巯基的捕获探针溶液，然后用HS- (CH2) n-EG2-0H室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c) Au-DNA的修饰:目标DNA滴加到自清洁表面反应I小时后，滴加Au-DNA溶液；(d)末端延伸:在末端延伸酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应15min，通过生物素-亲和素相互作用引入辣根过氧化物酶制得电化学传感器；
[0008]步骤三、电化学信号检测:将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。
[0009]步骤一中采用的重悬溶剂为PBST溶液，其中金纳米粒子的粒径为30nm，其溶液浓度为lnmol/L ;巯基标记信号探针的溶液浓度为3.3 μ mol/L。
[0010]步骤二(b)中捕获探针的浓度为0.5 μ mol/L,自组装时间大于4小时；HS- (CH2) n-EG2-0H浓度为0.5mmol/L，浸泡时间大于4小时。
[0011]步骤二(c)中Au-DNA溶液的浓度为0.5nmol/L，修饰时间为I小时。
[0012]步骤二(d)中末端延伸酶的浓度为1U，生物素标记的核苷酸(底物)为生物素标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，浓度为5.7 μπιοΙ/L，延伸时间为I小时。
[0013]步骤三中的电化学检测体系为三电极体系，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，其中，电解液为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液，循环伏安法高电位为0.7V，低电位为0V，扫描速度为0.lV/s ;时间电流曲线法的扫描电位为0.1V，扫描时间为100s。
[0014]步骤一和二中所述DNA序列如下:所述的5’端被标记的巯基标记信号探针序列为:5’-GAA ACC CTA TGT ATG CTC-SH-3’;所述的3’端标记巯基的捕获探针序列为:5’-SH_TTTT TTT TTT GTA TGA ATT ATA ATC AAA-3’ ；所述的目标DNA序列如下:完全互补序列GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TAA TTC ATA C、单个碱基错配序列5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3’、两个碱基错配序列 5，-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3，、三个碱基错配序列 5’ -GAG CAT GCA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATAC-3’或完全非互补序列 5，-ATCATC GAT ATC GTT CGA TAT CGT TAT CGA TTA TCG TTA TCATCG A-3，。
[0015]本发明与现有技术相比，具有以下特点:
[0016]1、检测灵敏度高:本发明对DNA的检测下限低于10fM，在现有的DNA检测传感器中处于较高的灵敏度水平。
[0017]2、检测的范围宽:本发明对DNA的检测范围宽度大于8个数量级，在现有的DNA传感器中处于较宽的检测宽度。
[0018]3、检测体系简单:本发明使用的检测方法为简单的电化学检测，对样本的颜色没有要求，灵敏度高，并且易于简单化和微型化。
[0019]4、实际应用性强:本发明的DNA传感器在模拟的血清样本中仍然具有较高的检测信号，说明本传感器在实际样本中的应用性强，有很高的临床诊断方面应用前景。
【附图说明】
[0020]图1是本发明基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法的过程示意图。
[0021]图2是本发明实施例1中的Au-DNA制备结果，图a为修饰信号探针前的吸光度曲线，b为修饰信号探针后的吸光度曲线。
[0022]图3是本发明实施例2-4中的条件优化结果图(其中A为实施例2，B为实施例3，C为实施例4) ο
[0023]图4是本发明实施例5中的对不同浓度目标DNA的电流图。
[0024]图5是本发明实施例6中的对完全互补及对照DNA片段检测电流对比图。
[0025]图6是本发明实施例7中在缓冲溶液和血清中目标DNA检测电流对比图。
【具体实施方式】
[0026]下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为了更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围:
[0027]如附图1中所示的步骤，搭建基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测体系，并进行电化学检测。
[0028](I)电化学传感器检测DNA体系的建立
[0029]a、金电极清洗:l)NaBH4S液浸泡(往NaBH 4固体中先加入一定体积的无水乙醇，再加入等体积的双蒸水，混匀后将电极浸泡在其中，浸泡15min，用双蒸水冲洗掉NaBH4S液)2)打磨(在磨布上倒上一定量的Al2O3粉末，然后加上少量水，将电极垂直在磨布上打磨3min，用超纯水冲洗干净)3)超声清洗(先用乙醇超声清洗4_5min，再用双蒸水超声清洗4-5min，用双蒸水冲洗)4)电化学扫描(以0.5mol/L的H2SO4为电解液，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，对金工作电极进行电化学扫描。先进行慢扫，然后加2V电压电解5s，再加-0.35V电压电解10s，而后快速扫描2次，清洗电极并且换H2SO4后慢扫I次，观察扫描的循环伏安图，若最后一次慢扫得到的两条曲线完全重合，并且氧化峰有四个，还原电流是最低电流的40倍，则判断电极清洗干净)清洗干净的电极用N2吹干，没有洗干净的电极则需要重复清洗步骤。
[0030]b、自清洁表面制备:1)以5XPBS稀释5’端巯基标记的捕获探针至所需浓度得到组装液，在清洗干净并用N2吹干的电极表面滴加3 μ L组装液，使组装液覆盖在金电极表面，确保组装液与金电极表面完全接触，且液滴中不含有气泡，在电极上加盖1.5ml离心管以减少反应过程中组装液的蒸发且避免杂质进入组装液，在室温下反应4h以上。2)以无水乙醇稀释HS-(CH2) n-EG2-0H至所需浓度，分装在2ml离心管中，100 μ L/管，将组装好的电极用PBS溶液冲洗10s，并用N2吹干，然后将电极表面浸泡在制备好的封闭液中，确保电极表面与封闭液完全接触没有气泡，用密封膜缠好离心管与电极，减少封闭液的蒸发，室温下反应4h以上。
[0031]c、目标DNA杂交:以5XPBS稀释目标DNA片段至所需浓度得到杂交液，将HS-(CH2)n-EG2-0H处理后的电极用PBS冲洗10s，且用N2吹干，然后将稀释的杂交液滴加3 μ L在干燥的电极表面，在电极上加盖1.5ml离心管，在反应过程中减少组装液的蒸发且避免杂质进入组装液，在室温下反应lh。
[0032]d、信号探针的修饰:将杂交后的电极用PBS溶液冲洗10s，并且用N2吹干，吹干后的电极表面滴加3 yL Au-DNA溶液，加盖1.5ml离心管后，室温下反应lh。
[0033]e、末端延伸:将杂交后的电极用PBS溶液冲洗10s，并且用N2吹干，吹干后的电极表面滴加3 μ L末端延伸液(末端延伸酶的浓度为1U，底物为浓度5.7 μ mol/L的生物素标记腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)，加盖1.5ml离心管后，室温下反应lh。确保延伸液与金电极表面完全接触。
[0034]f、辣根过氧化物酶标记:将延伸后的电极用PBS溶液冲洗，并且用N2吹干，吹干后的电极表面滴加3 μ L生物素标记辣根过氧化物酶溶液，加盖1.5ml离心管后，室温下反应15min。
[0035](2)电化学信号的检测
[0036]将标记好辣根过氧化物酶的电极用PBS溶液冲洗，以市售3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液为电解液，用三电极体系进行检测，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂电极。循环伏安图的高电位为0.7V，低电位为0V，扫描速度为0.lV/s ;时间电流曲线的实验电位为
0.1V，试验时间为10s0
[0037]实施例1:Au_DNA的制备及其结果
[0038]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，制备Au-DNA操作如下:将100mL的金纳米粒子溶液离心浓缩至300 μ L，其终浓度约为lnmol/L ;缓慢加入20 μ L浓度为50 μ mol/L的5’端巯基标记的信号探针溶液，其终浓度为3.3 μ mol/L ；以350rpm转速振荡反应16小时后加入等体积0.02mol/L PBS (PH =
7,0.2mol/L NaCl)，陈化 40 小时;以 1000rpm 转速离心 15 分钟，加入 0.01mol/L PBS (PH=7，0.lmol/L NaCl)，以 1000rpm 转速离心 15 分钟，分别以 PBS (0.01M, 0.25M NaCl, PH =7)、PBST (0.01M, 0.25M NaCl, 0.1 % 吐温，PH = 7)、PBSB (0.01M, 0.25M NaCl，I %小牛血清白蛋白，PH = 7)重悬，制得Au-DNA溶液。对制备的Au-DNA溶液进行紫外检测，考察其粒径，其结果如图2所示，a为修饰巯基标记信号探针前的吸光度曲线，b为修饰巯基标记信号探针后的吸光度曲线，表明在修饰信号探针前后金纳米粒子的粒径没有发生很大的变化，也即在修饰过程中很好地控制了团聚现象；对制备的Au-DNA溶液进行稳定性考察，在加入2倍体积的饱和氯化钠之后，没有修饰的金纳米粒子溶液由红色变为紫色，而Au-DNA溶液保持红色不变，说明Au-DNA溶液在高盐溶液中有更好的稳定性，也说明了 Au-DNA溶液的制备是成功的。
[0039]实施例2:不同的组装密度对电化学信号检测结果的影响。
[0040]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，以完全互补DNA序列作为目标片段，所有操作步骤都如上所述，其中封闭液HS- (CH2) n-EG2-0H的浓度为0.5mmol/L，目标DNA的浓度为I μ mol/L,组装密度依次为10、
5、1、0.5、0.2、0.1 ymol/L，分析不同的组装密度对检测电化学信号的影响，其分析结果如附图3(A)所示，在0.5 μ mol/L之前，随着组装密度的降低信噪比增强，在0.5 μ mol/L之后，随着组装密度的降低信噪比减弱，因此组装密度的较优条件为0.5 ymol/L。
[0041]实施例3:不同的HS-(CH2) n-EG2-0H封闭浓度对电化学检测结果的影响。
[0042]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，以完全互补DNA序列作为目标片段，所有操作步骤都如上所述实施例2所述，其中组装密度为0.5 μ mol/L,目标DNA的浓度为I μ mol/L,封闭液HS- (CH2) n-EG2_0H的浓度依次为2、1.5, U0.5,0.1、0mmol/L分析不同的HS-(CH2) n-EG2_0H浓度对检测电化学信号的影响，其分析结果如附图3(B)所示，在0.5mmol/L之前，随着HS-(CH2)n-EG2-0H浓度的降低信噪比增强，在0.5mmol/L之后，随着HS- (CH2) n-EG2_0H浓度的降低信噪比减弱，因此HS-(CH2) n-EG2-0H 浓度的较优条件为 0.5mmol/L。
[0043]实施例4:不同Au-DNA分散液对电化学检测结果的影响。
[0044]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，以完全互补DNA序列作为目标片段，所有操作步骤都如上所述实施例2所述，其中组装密度为0.5ymol/L，HS-(CH2)n-EG2-0H封闭浓度为0.5mmol/L，目标DNA的浓度为I μ mol/L, Au-DNA分散液依次为:PBS、PBSB, PBST,分析不同的分散液对检测电化学信号的影响，其分析结果如附图3 (C)所示，当Au-DNA的分散液为PBST时的本底浓度较小，信噪比最好，因此Au-DNA的较优分散条件为PBST。
[0045]实施例5:基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法对不同浓度目标DNA片段的检测特性。
[0046]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，以完全互补DNA序列作为目标片段，所有操作步骤都如上所述实施例2所述，其中组装密度为0.5 yM，HS-(CH2)n-EG2-0H封闭浓度为0.5mmol/L，Au-DNA分散液为PBST，待测目标 DNA 的浓度依次为:1 μ mol/L、100nmol/L、10nmol/L、lnmol/L、100pmol/L、1pmol/L、lpmOl/L、100fmOl/L、10fmOl/L，分析不同浓度待测DNA片段的电化学信号响应特性，分析结果如图4所示，在该检测范围内，电化学信号随DNA片段浓度的增加呈指数关系，检测限低于10fmol/Lo
[0047]实施例6:基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法对互补及对照DNA片段的电化学信号对比。
[0048]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，所有操作步骤都如上所述实施例2所述，其中组装密度为0.5 μ mol/L,HS- (CH2) n-EG2-0H封闭浓度为0.5mmol/L, Au-DNA分散液为PBST，待测目标DNA的浓度为lnmol/L,目标DNA片段依次为a完全互补、b单个碱基错配、c两个碱基错配、d三个碱基错配和e非互补序列，分析电化学传感器的特异性，分析结果如图5所示，由图可知，本发明的电化学传感器检测DNA的方法能够区分单个碱基的错配，有高的特异性。
[0049]实施例7:基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法对缓冲液及血清中DNA片段的电化学信号对比。
[0050]采用本发明所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，以完全互补DNA序列作为目标片段，所有操作步骤都如上所述实施例2所述，其中组装密度为0.5 μ mol/L, HS- (CH2) n-EG2_0H封闭浓度为0.5mmol/L，Au-DNA分散液为PBST,待测目标DNA的浓度为lnmol/L，目标DNA的分散液为PBS缓冲溶液和血清，分析电化学传感器对血清中目标DNA的检测效果，分析结果如图6所示，，虽然检测的电流信号没有缓冲液中那么好，但仍能够很好地检出血清中的目标DNA，显示了很好的实际运用前景。
【主权项】
1.一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、Au-DNA溶液的制备:在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’端被标记的巯基标记信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬； 步骤二、电化学传感器的制备:(a)金电极的清洗=WNaBH4溶液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面:室温下在金电极表面自组装3’端标记巯基的捕获探针溶液，然后用HS- (CH2) n-EG2-0H室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c )Au_DNA的修饰:目标DNA滴加到自清洁表面反应I小时后，滴加Au-DNA溶液；(d)末端延伸:在末端延伸酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应15min，通过生物素-亲和素相互作用引入辣根过氧化物酶制得电化学传感器； 步骤三、电化学信号检测:将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。2.如权利要求1所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，步骤一中采用的重悬溶剂为PBST溶液，其中金纳米粒子的粒径为30 nm，其溶液浓度为I nmol/L ;5’端被标记的巯基标记信号探针溶液浓度为3.3 ymol/L03.如权利要求1所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，步骤二(b)中捕获探针的浓度为0.5 μ mol/L，自组装时间大于4小时；HS-(CH2) n-EG2-0H浓度为0.5 mmol/L，浸泡时间大于4小时。4.如权利要求1所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，步骤二(c)中Au-DNA溶液的浓度为0.5 nmol/L,修饰时间为I小时。5.如权利要求1所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，步骤二(d)中末端延伸酶的浓度为I U，生物素标记的核苷酸为生物素标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，浓度为5.7 μ mol/L,延伸时间为I小时。6.如权利要求1所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，步骤三中的电化学检测体系为三电极体系，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，其中，电解液为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺溶液，循环伏安法高电位为0.7 V，低电位为O V，扫描速度为0.1 V/s ;时间电流曲线法的扫描电位为0.1 V，扫描时间为100 S07.如权利要求1所述的基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测DNA的方法，其特征在于，步骤一和步骤二中所述DNA序列如下:5’端被标记的巯基标记信号探针序列为:5’ -GAA ACC CTA TGT ATG CTC-SH-3’ ；3’端标记巯基的捕获探针序列为:5’ -SH-T TTT TTT TTT GTA TGA ATT ATA ATC AAA-3’ ；目标 DNA 序列如下:完全互补序列GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TAA TTC ATA C、单个碱基错配序列5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3’、两个碱基错配序列 5，-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATA C-3，、三个碱基错配序列 5’ -GAG CAT GCA TAG GGT TTC TAT TGG TTT CTT TGA TTA TGA TTC ATAC-3’或完全非互补序列 5，-ATCATC GAT ATC GTT CGA TAT CGT TAT CGA TTA TCG TTA TCATCG A-3，。
【文档编号】G01N33/68GK105842453SQ201510015158
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月12日
【发明人】万莹, 王鹏娟, 苏岩, 杨树林
【申请人】南京理工大学